A.1.2 NCP 145

C = 5 m g /m l) /K ( u .a .) q (Å^-1)

Figure V-4 : Variation de l'intensité diffusée I(q, C= 5 mg/ml) normalisée par le contraste K pour C_s = 160, 450 mM et 1M. Les courbes obtenues pour C_s < 160 mM ne sont pas présentées car elles sont identiques à la courbe obtenue pour C_s= 160 mM pour q> 0,05 Å^-1. Le changement de forme des particules est très clairement visible à C_s = 450 mM, pour q>0,085 Å^-1. Dans un souci de clarté, ces courbes ont été lissées. La procédure de lisage consiste, pour chaque valeur de q, à faire une moyenne de I(q) sur les 5 points expérimentaux de part et d'autre du point considéré.

Nous ne nous intéresserons pas plus en détail au changement de forme observé à forte concentration saline. Nous préférons, dans la suite de ce travail, nous attacher à la gamme de concentration ionique qui est biologiquement pertinente et où les particules sont stables (C_s< 200 mM). Le principal résultat obtenu à partir des expériences présentées ci-dessus est l'augmentation de l'extension maximum de la particule (Dmax) entre Cs = 50 mM et 160 mM. Nous avons donc décidé de réaliser une nouvelle série d'expériences, dont le but est de nous affranchir sans aucun doute de l'effet des interactions entre particules, mais aussi de réaliser plus de points dans la gamme des concentrations inférieures à 160 mM.

V.A.1.2 NCP145

A partir d'une solution de NCP ayant une longueur d'ADN associée de 145 pb (NCP145), avec une polydispersité plus faible (± 3 pb), nous avons exploré la zone de concentration saline compatible avec la stabilité des particules (Cs < 200 mM). La Figure V-5 présente les

courbes de diffusion obtenues pour les faibles valeurs de q, pour différentes concentrations salines et pour une concentration en particules de 4 mg/ml. Comme pour NCP₁₆₅, on observe un écrantage des interactions lorsque la concentration saline de la solution augmente. La courbe enregistrée pour C_s = 10 mM est pratiquement plate pour les plus faibles valeurs de q. Ce comportement caractéristique d'interactions répulsives entre particules disparaît pour les concentrations salines supérieures. Au-dessus de 75 mM, l'intensité diffusée aux faibles valeurs de q présente un changement de courbure laissant suggérer la présence d'interactions attractives entre particules.

0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 10 mM 25 mM 37.5 mM 50 mM 75 mM 100 mM 150 mM 200 mM I( q , C = 4 m g/ m l) ( u .a .) q(Å^-1)

Figure V-5 : Courbes de diffusion aux petits angles enregistrées pour une concentration en NCP₁₄₅ de 4 mg/ml I(q, C = 4 mg/ml) et différentes concentrations ioniques entre 10 et 200 mM. La variation de contraste dans cette gamme de sel étant faible (moins de 3%) les courbes ne sont pas normalisées par le contraste K.

Pour chaque concentration saline, nous avons fait varier la concentration en NCP de 0,5 mg/ml à 4 ou 8 mg/ml, afin de déterminer avec précision l'effet des interactions. Pour les concentrations salines inférieures à 75 mM, les courbes Ln I(q,C) en fonction de q² sont linéaires dans la zone de Guinier (qRg£ 1,3), exception faite de la courbe à 10 mM et CNCP=4 mg/ml, qui présente un plateau pour les petites valeurs de q. Dans ces conditions, I(q, C_NCP) peut être extrapolée à q = 0, permettant le calcul du deuxième coefficient du viriel en utilisant l'équation (III.13). Les valeurs obtenues sont résumées dans le Tableau V-2.

NCP₁₄₅ C_s = 10 mM C_s = 25 mM C_s = 37,5 mM C_s = 50 mM C_s = 75 mM A₂ (ml.mol.g^-2) 15.10^-5± 2.10-5 4,5.10^-5± 1,5.10-5 3.10^-6± 3.10-6 -5.10^-6± 5.10-6 -2.10^-5± 1.10-5

Tableau V-2 : Valeurs du deuxième coefficient du viriel pour différentes concentrations salines. Les mesures ont été faites sur NCP₁₄₅.

La valeur de A2 diminue progressivement et devient négative pour une concentration saline comprise entre 37,5 et 50 mM. Ceci indique que les interactions entre particules, répulsives pour les faibles concentrations salines, deviennent attractives pour les concentrations salines supérieures. Au-dessus de 75 mM, les courbes ln I(q, CNCP) en fonction de q² ne sont plus linéaires, et présentent une augmentation de courbure pour les très faibles valeurs de q. Ce comportement peut être attribué à des interactions attractives dans une solution monodisperse, ou à la formation d'oligomères, conséquence de cette attraction. A cause de cette augmentation de courbure, l'extrapolation de I(q, CNCP) à q=0 ne peut pas être correctement effectuée pour des concentrations supérieures à 100 mM et pour C_NCP³ 2 mg/ml. Dans ces conditions, la détermination du second coefficient du viriel n'a pu être effectuée pour les concentrations salines supérieures à 75 mM.

Nous avons ensuite cherché à obtenir le facteur de forme des NCP, non affecté par les effets des interactions. D'après ce qui précède, la procédure utilisée doit dépendre de la concentration saline de la solution. A C_s=10 mM, les interactions répulsives entre particules sont suffisamment importantes pour que les courbes enregistrées à 0,5 et 1 mg/ml présentent des différences significatives pour q < 0,03 Å^-1. Les données enregistrées à 0,5, 1 et 2 mg/ml sont extrapolées à dilution infinie en utilisant un "Zimm-plot" (Zimm, 1948). Dans le cas où les interactions entre particules sont modérées, qu'elles soient répulsives (25 et 37 mM) ou attractives (50 et 75 mM), les courbes enregistrées à 0,5 et 1 mg/ml ne présentent pas de différences significatives, supérieures aux barres d'erreurs. La courbe obtenue pour une concentration en particule de 0,5 mg/ml peut alors être considérée comme non affectée par les interactions. Pour les concentrations salines supérieures (100, 150 et 200 mM), les interactions attractives entre particules sont plus fortes. Cependant, les courbes de diffusion enregistrées pour une concentration en particule de 0,5 mg/ml présentent peu de différence par rapport aux courbes enregistrées pour les concentrations salines inférieures (50 et 75 mM). De plus, la valeur de l'intensité extrapolée à q=0, I(0, C_NCP) pour l'échantillon le plus dilué, C_NCP = 0,5 mg/ml, est constante pour toutes ces concentrations salines. Les courbes

enregistrées pour la concentration la plus faible (0,5 mg/ml) sont donc là encore considérées comme non affectées par les interactions.

0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012 0.0014 0 40 80 120 160 10 mM 25 mM 200 mM 50 mM P( r) /I (0 ) r(Å)

(a)

(b)

Figure V-6 : Caractérisation de la forme des NCP145 en fonction de la concentration saline. (a) Fonction de distribution des distances P(r) calculée pour quatre concentrations salines à partir des courbes I(q) construites de la façon suivante: pour q < 0,05 Å^-1 , I(q)=I(q, C = 0,5 mg/ml); pour q > 0,05 Å^-1, I(q)=I(q, C = 4 ou 8 mg/ml). Les courbes P(r) sont normalisées par l'intensité I(0).

(b) Variation de l'extension maximale D_max des particules en fonction de la concentration saline. Les deux lignes correspondant à D_max = 131 et 160 Å sont

En résumé, dans la région des petites valeurs de q (région où l'effet des interactions peut se faire sentir), le facteur de forme des NCP est assimilé à la courbe I(q, C_NCP= 0,5 mg/ml) pour toutes les concentrations salines C_s, à l'exception de C_s=10 mM. Pour cette valeur de C_s, le facteur de forme est assimilé à la courbe I(q, C_NCP=0) extrapolée à dilution infinie. Par contre, dans la région des grandes valeurs de q, où l'effet des interactions n'intervient plus, il est préférable d'utiliser la courbe I(q, C_NCP) mesurée pour la concentration C_NCP la plus élevée (4 ou 8 mg/ml), dans le but d'améliorer la statistique. Les facteurs de forme ainsi construits sont alors utilisés pour calculer les fonctions de distribution des distances P(r) présentées sur la Figure V-6 (a). On en déduit l'évolution de l'extension maximale D_max du NCP en fonction de la concentration saline C_s (Figure V-6 (b)).

Entre 10 mM et 50 mM, l'extension maximale des particules D_max augmente de 137 à 165 ± 5 Å, et reste constante pour les concentrations salines supérieures, jusqu'à Cs =200 mM (Figure V-6 b). De la même manière, les valeurs des rayons de giration, obtenues à partir de l'approximation de Guinier ou calculées à partir de la fonction P(r), présentent une augmentation entre 10 et 50 mM puis restent constantes pour les concentrations supérieures. La Figure V-7 présente les variations des rayons de giration en fonction de la concentration saline. La petite différence observée entre les deux séries de valeurs est probablement due au fait que la région angulaire (0,0147 £ q £ 0,0309 Å-1

), utilisée pour le calcul des valeurs du rayon de giration dans l'approximation de Guinier, n'atteint pas des valeurs de q assez petites. Les valeurs du rayon de giration seraient donc sous-estimées dans ce cas.

42 43 44 45 46 47 0 50 100 150 200 250 R g(Guinier) R g(P(r)) R ^g (Å ) C s (mM)

Figure V-7 : Variation du rayon de giration des NCP₁₄₅ en fonction de la concentration saline. Les valeurs de R_g(Guinier)ont été calculées à partir de l'approximation de Guinier et R_g(P(r)) à partir de la fonction P(r). Les valeurs de Rg= 43Å et Rg= 45Å, indiquées par les deux lignes horizontales, sont obtenues à partir des courbes I(q) calculées pour la particule cœur de nucléosome avec les queues respectivement repliées et étendues (voir paragraphe V.A.2.2.a)