F Discussion

q) ( u. a. ) q (Å^-1)

Figure IV-16 : Variation de l’intensité diffusée pour une concentration en NCP variant de 5 à 250 mg/ml et pour une concentration saline de 15 mM.

IV.F Discussion

Dans les paragraphes précédents, nous avons étudié précisément l'organisation des particules cœur de nucléosomes en faisant varier systématiquement la concentration en sel ajouté de la solution, et la pression osmotique des échantillons. Ces expériences nous ont permis de montrer que l'organisation des particules est fortement dépendante de la concentration saline de la solution, mais aussi de la concentration initiale des particules avant application du stress osmotique, et du temps d'équilibration des échantillons. La Figure IV-17 résume les organisations observées en fonction de ces paramètres.

Pour les faibles concentrations salines, inférieures ou égales à 25 mM, nous observons une phase lamellaire de bicouches. Au sein de chacune des deux couches d'une lamelle, les

NCP sont organisées régulièrement suivant un réseau monoclinique à deux dimensions. L’augmentation de la pression osmotique dans l’échantillon de 4,7.10⁵ à 2,35.10⁶ Pa provoque une diminution de la distance entre lamelles de 376 à 358Å. La distance entre colonnes et la distance entre NCP au sein d'une colonne diminuent dans les mêmes proportions de 111,4 à 104,4 Å et de 59,8 à 57,1 Å respectivement. Nous avons calculé que pour cette gamme de pression osmotique, la concentration en NCP dans cette phase varie de 271 à 316 mg/ml. L’équilibre de la phase lamellaire semble être obtenu relativement rapidement, en environ 1 mois. D’autre part, nous avons pu montrer que l’organisation de cette phase dense ne semble pas dépendre de la concentration initiale en NCP, et ne s'oriente pas sous champ magnétique.

Le comportement obtenu pour les fortes concentrations salines est complètement différent et présente une organisation hexagonale, organisée à deux ou trois dimensions suivant la concentration initiale en NCP avant l’application du stress osmotique. Quelle que soit l’organisation considérée, ces phases tendent très lentement vers leur état d’équilibre. Nous avons pu montrer que même 7 mois après leur préparation, les distances caractéristiques entre particules continuent d'évoluer. Pour une concentration initiale en NCP avant l’application du stress osmotique égale à 220 mg/ml, et pour une pression osmotique égale à 4,7.10⁵ Pa, les NCP présentent une organisation colonnaire hexagonale à deux dimensions. Les distances entre colonnes et entre NCP dans une colonne diminuent respectivement de 116 à 110Å et de 60 à 57,7Å, quand le temps d’équilibration augmente de 1 à 17 mois. La concentration en NCP dans cette phase varie donc au cours du temps de 491 à 568 mg/ml. Pour une concentration initiale en NCP de 260 mg/ml, et pour des pressions osmotiques variant de 4,7.10⁵ à 1,3.10⁶ Pa, les particules présentent une organisation à trois dimensions. En première approximation, la maille cristalline est orthorhombique, avec b»aÖ3 (ce qui indique qu'on est très proche d'un ordre hexagonal) et c=2h, h étant la distance entre deux NCP le long d'une colonne. L’augmentation de la pression osmotique provoque une diminution des trois paramètres a, b, c de 115,4 à 110,1 Å, de 203,6 à 194,0 Å et de 119,0 à 112,7 Å respectivement. Ces variations correspondent à une augmentation de la concentration finale en NCP de 484 à 572 mg/ml. Il est intéressant de noter que cette phase peut être partiellement alignée sous champ magnétique, ce qui facilite son étude. Sous les mêmes pressions les concentrations sont très comparables dans les phases colonnaire hexagonales 2D et 3D.

Démixtion

C

=220 mg/ml

C

=260 mg/ml

Hexagonale 2D

Orthorhombique

quasi-hexagonale 3D

C (mM)

Lamellaire Hexagonale

Lamellaire

25 mM 37 mM 50 mM 100 mM 160 mM

271< C

< 316 mg/ml

d

h

a

c

a

491< C

< 568 mg/ml

484 < C

< 572 mg/ml

- Pas d’orientation sous champ - Peu sensible à C_iNCP

- Equilibre très lent - Orientation sous champ - 2D ou 3D suivant C_iNCP - Equilibre très lent, d’autant plus lent

que C est faible et que la pression osmotique est élevée - Sous champ, on observe directement une phase hexagonale sans passage par une phase désordonnée

iNCP

Colonnaire

isotrope

Nématique

b

Figure IV-17 : Tableau synthétique résumant l'organisation des particules cœur de nucléosome en fonction de la concentration saline de la solution, et de la concentration initiale en NCP CiNCP avant application du stress osmotique. L'effet du champ magnétique et du temps d'équilibration sont aussi indiqués. C_NCP représente la concentration finale en NCP

Pour une concentration saline intermédiaire, égale à 37 mM, la mise en ordre des NCP se fait très lentement, et dépend de la concentration initiale en NCP avant l’application du stress osmotique. Pour une concentration initiale de 220 mg/ml, et un mois après leur préparation, les NCP présentent une phase désordonnée de colonnes (isotrope ou nématique), qui évolue vers une démixtion entre une phase lamellaire et une phase hexagonale. Pour une concentration initiale en NCP plus élevée, on observe également une démixtion mais qui se produit plus rapidement. L’utilisation d’un champ magnétique provoque directement l'apparition de la phase hexagonale, sans passage par une phase désordonnée.

En résumé, pour les faibles concentrations salines, on observe une phase lamellaire avec une concentration de l’ordre de 300 mg/ml, alors que l’on observe une phase hexagonale à forte concentration saline, avec une concentration en NCP de l’ordre de 500 mg/ml. Nous n’avons observé aucune autre phase supplémentaire à l’équilibre. Pour une pression osmotique fixée, l’augmentation de la concentration saline provoque donc une transition entre un état relativement peu dense à faible concentration saline, et un état plus dense à fort sel. Il est intéressant de noter qu'un comportement de même type est observé pour la fibre de chromatine pour laquelle l’augmentation de la concentration saline de la solution provoque la transition entre la fibre de 10 nm (forme relâchée) et la fibre de 30 nm (forme compacte) (Widom, 1986; voir Figure II-6).