La NADPH Oxydase des neutrophiles : Structure et composants

3.3.1 Le cœur catalytique NOX2 / gp91

La sous-unité gp91phox également nommée NOX2 (sous-unité β du cytochrome b558) est

l’élément essentiel du complexe formant la NADPH oxydase active. Elle est constituée de 570 acides aminés et d’une masse moléculaire de 65.3 kDa. Contrairement à d’autres NOX, elle apparaît avec une taille de 91 kDa sur un gel de SDS-PAGE du fait des glycosylations hétérogènes sur trois de ses résidus asparagine (Asn 132, Asn149 et Asn240) (Wallach TM et Segal AW, 1997). Au repos, 60 à 70% de la NOX2 est localisée dans la membrane des granules spécifiques, 20 à 25% se situe dans la membrane des granules tertiaires et le reste est distribué entre la membrane plasmique et des vésicules

Homologue (homogie séquence) Distribution tissulaire Localisation cellulaire Fonction NOX1 (60%)* NOX2 Cellules myéloïdes, moelle osseuse Lympocytes B, neuronne, cardyomyoctes, hépatocytes Membranes intracellulaires (granules), membrane plasmatique, région périnucléaire (muscles lisses), mitochondries Défense immunitaire, signalisation? NOX3 (56%)* NOX4 (39%)* NOX5 (27%)* DUOX1/DUOX2 (50%)*

* Homologie séquence vis à vis de NOX2 En gras : Localisations et fonctions majoritaires (?) : Source de débat

Nodules lymphatiques, rate, testicules, rein, utérus.

Signalisation ? Capacitation ? Thyroïde, poumon, glandes salivaires, tractus gastro- intestinal. Synthèse hormonale, défense immunitaire? Signalisation? Membrane plasmique, endosomes Membrane plasmique Reticulum endoplasmique membrane plasmique Noyau Réticulum endoplasmique, membrane plasmique Membrane plasmique Colon, utérus, C. vasculaires du muscle lisse, prostate, rétine,

ostéoclastes Régulation de la pression artérielle, Défense de l’hôte? Oreille interne , tissus fœtaux. Biosynthèse de l’otoconie Rein, endothélium, ostéoclastes, fibroblastes. Senseur de l’oxygène? vasorégulation ? Signalisation ?

53 sécrétoires (Borregaard N et al, 1983 ; Kjeldsen L et al, 1994). La partie N-terminale (300 acides aminés) de la protéine prend la forme de 6 boucles transmembranaire disposées en hélices α. Deux groupements héminique sont localisés entre les transmembranes III et V. La partie C-terminale constitue un domaine cytoplasmique comportant des sites de liaison du FAD et du NADPH.

Schéma 12 : Modèle structural de la gp91phox (Bedard et Krause, 2007)

3.3.2 La p22

La p22phox comprend 195 acides aminés constituant une protéine de 22 kDa. Dans le neutrophile, la p22phox est associée à NOX2 à la membrane et y forme un complexe équimoléculaire (le cytochrome b558). Néanmoins, contrairement à NOX2 il s’agit d’une protéine ubiquitaire qui est nécessaire à la stabilisation et l’activation de la majorité des autres NOX à l’exception de NOX5 et DUOX1/2. La partie N-terminale de la protéine est composée de deux hélices α transmembranaires alors que la partie C-terminale cytoplasmique contient un domaine riche en proline appelé PRR (Proline-Rich Region) comportant un motif consensus PxxP (Pro-Xaa-Xaa-Pro). Elle lie la p47phox lorsque cette dernière est phosphorylée.

54 Schéma 13 : Modèle structural de la p22phox

3.3.3 La p47

La sous-unité p47phox est une protéine monomérique de 47 kDa constituée de 390 acides aminés se situant principalement dans le cytosol du neutrophile à une concentration de 100-150 ng/106 cellules. La p47phox comprend de nombreux domaines qui facilitent son attachement aux lipides membranaires et aux autres composants du complexe NADPH oxydase. La partie N-terminale de la protéine comporte un domaine PX (Phox Homology, aa : 4-121) qui lui permet de s’associer aux phospholipides membranaires, deux tandems SH3 (SH3A, aa : 159-214 et SH3B, aa : 229-284) suivis de la région d’auto-inhibition AIR (Autoinhibitory Region, aa : 292-340). La partie C-terminale de la protéine est très basique et est riche en résidus sérines et arginines et comporte le domaine PRR (Proline Rich Region, aa : 363-369) qui permet l’interaction de la p47phox avec un domaine SH3 de la p67phox dans le cytosol du neutrophile au repos (El-Benna J et al, 2009). La p47phox est phosphorylée sur plusieurs résidus sérine situés dans la région AIR durant l’activation de la NADPH oxydase (El- Benna J et al, 1994) et constitue la sous-unité responsable de l’association du complexe cytosolique p40phox-p47phox-p67phox au cytochrome b558 (gp91phox-p22phox) au cours de l’activation de la NADPH

oxydase. Cependant, il a été proposé qu’elle ne serait pas absolument nécessaire à l’activation de la NOX2 lorsque que la p67phox est à forte concentration car in vitro la production d’O2-° est mesurable

en absence de p47phox (Freeman JL et al, 1996).

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3.3.4 La p67

La p67phox _{est une protéine de 526 acides aminés. Les domaines fonctionnels de la p67}phox consistent en 4 motifs TPR (Tetratricopeptide Repeat), un domaine activateur (AD), un domaine PB1 (Phox-Bem1) et un tandem SH3 en C-terminal (Yang HC et al, 2011). Le recrutement membranaire de la p67phox suite à la stimulation des neutrophiles est dépendant de la p47phox. L’association p67- p47phox _{s’effectue via l’interaction entre le domaine PRR de la p47}phox _{et SH3 de la p67}phox _{ainsi dans} le cytosol des neutrophiles au repos elle forme un complexe avec la p47phox (Lapouge K et al, 2002). Une fois à la membrane, la p67phox _{s’associe à Rac et le complexe p67}phox_{-Rac induit un changement} conformationnel de NOX2 permettant le transfert des électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire (Paclet MH et al, 2007 ; Diebold BA et Bokoch GM, 2001).

Schéma 15 : Les domaines de la p67phox _{(d’après Groemping Y et Rittinger K, 2005)}

3.3.5 La p40

La sous-unité cytosolique p40phox _{est le dernier composant de la NADPH oxydase à avoir été} identifié par co-immunoprécipitation avec la p67phox _{et la p47}phox _{(Someya A et al., 1993). Il s’agit} d’une protéine de 40 kDa et de 339 acides aminés comportant un domaine SH3, un domaine PX et un domaine PB1. Elle interagit avec la p67phox via son domaine PB1 alors que son domaine SH3 semblerait interagir mais faiblement avec le domaine PRR de la p47phox (Fuchs A et al, 1995). Le domaine PX de la p40phox se lie spécifiquement aux phosphoinositides triphosphate membranaires qui s’accumulent dans la membrane phagosomale, ce qui pourrait contribuer à faciliter l’assemblage du complexe à cet endroit de la cellule. La découverte récente d’un patient exprimant une p40phox _mutante a permis d’attribuer à celle-ci un rôle dans la translocation de la p47phox _{et l’activation de la NADPH} oxydase (Chessa TA et al, 2010).

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3.3.6 Rac

Deux isoformes de Rac existent (Rac 1 et 2) dans le neutrophile où ils partagent 92% d’homologie. L’isofome Rac2 est prédominante dans le neutrophile ; elle est monomérique et possède une masse moléculaire de 21 kDa. La protéine comporte 192 acides aminés et appartient à la sous- famille des Rho GTPases. Ces petites GTPases sont des régulateurs clés d’une large variété de voies de signalisation intracellulaires et régulant le réarrangement du cytosquelette et le chimiotactisme, l’adhésion cellulaire, la phagocytose et la survie cellulaire. Elles sont maintenues inactives lorsqu’elles sont liées au GDP mais sous l’action de GEFs (Guanosine Exchange factors) il y a un échange de ce GDP par le GTP qui permet à Rac d’être sous une forme active. Dans le neutrophile au repos, Rac2 et Rac1 sont retenues dans le cytosol dans un état inactif, liées au GDP et à leur inhibiteur Rho-GDI (GDP Dissociation Inhibitor) qui masque le motif géranygéranyl de la GTPase (Werner E, 2004). Une stimulation appropriée induit la dissociation de Rho-GDI de Rac, le motif géranygéranyl est démasqué et permet l’association de Rac à la membrane d’une manière indépendant du trimère p40-p47-p67phox (Groemping Y et Rittinger K, 2005).