II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
3.4 L’activation de la NOX2
3.4.1 La NADPH oxydase 2 dans les cellules quiescentes
Dans des neutrophiles quiescents la NOX2 est constitutivement associée à la p22phox. Cette association est nécessaire puisqu’elle garantit la stabilité de la NOX2 (Parkos CA et al, 1989). Les protéines cytosoliques p47phox, p40phox et p67phox forment un complexe stœchiométrique et d’une masse moléculaire comprise entre 250 et 300 kDa (Park JW et al, 1994). En effet, ces protéines cytosoliques comportent des domaines d’interaction protéine-protéine tels que les domaines SH3, PX, PC (Schéma 17). Ces domaines confèrent une conformation précise des protéines au repos mais également leur permet de s’associer entre elles. La p47phox joue un rôle central dans le processus d’activation du complexe NADPH oxydase du fait de sa capacité à lier à la fois la p22phox et le complexe formé de la p67phox et p40phox. Cependant, dans les cellules non stimulées, elle adopte une conformation repliée sur elle-même : les deux domaines SH3 sont masqués par le domaine d’auto- inhibition AIR tandis que le domaine PX est lui aussi inaccessible. Ceci contribue à réduire l’association des éléments cytosoliques à la membrane plasmique. Ainsi, dans les cellules quiescentes, la NOX2 est maintenue dans une forme inactive au niveau des granules et séparée de ses partenaires cytosoliques maintenus dans le cytosol.
57 Schéma 17 : Modèle d’interaction entre les composants cytosoliques de la NADPH oxydase (d’après Lapouge K et al, 2002)
3.4.2 La phosphorylation des éléments du complexe NADPH oxydase et
translocation membranaire des composants cytosoliques
Durant la stimulation du neutrophile les éléments de la NADPH subissent des phosphorylations nécessaires à l’activation de la NOX2.
a) p47phox :
La p47phox est intensément phosphorylée in vitro puisqu’on y dénombre 11 sites de phosphorylations sur des sérines au niveau de la région C-terminale : les sérines 303, 304, 310, 315, 320, 328, 345, 348, 359, 370, 379. Ces phosphorylations sont induites par de nombreuses protéine kinases après activation via le fMLP : Les PKC, PAK, ERK1/2, p38-MAPK et AKT. Seule la mutation de la sérine 379 en alanine a complètement inhibé l’activité de la NADPH oxydase (Faust LR et al, 1995). La mutation des sérines 303, 304, 310, 328, 345, 359 ou 370 en alanine n’a que partiellement inhibé l’activité de la NADPH oxydase (Faust LR et al, 1995). Par contre la mutation en alanine de la sérine 348 n’a eu aucun effet. Une grande partie de ces sérines essentielles à l’activation de la NADPH oxydase se retrouvent sur le domaine d’auto-inhibition AIR (compris entre les S303 et S328) où elles sont difficiles d’accès pour les protéines kinases dans les cellules non stimulées.
58 Les différentes phosphorylations de la p47phox se feraient de manière séquentielle et auraient des fonctions déterminées dans la séquence d’activation de la protéine et du complexe. Ainsi, de récents travaux de l’équipe d’accueil (Dang PM et al, 2006 ; Boussetta T et al, 2010) ont mis en évidence un rôle central de la sérine 345 dans la pré-activation (priming) des neutrophiles par le TNF-
. Sa phosphorylation permettrait un dépliement partiel de la p47phox facilitant la phosphorylation des autres sérines. La phosphorylation des sites S303-304 et 328 se trouvant dans le domaine d’auto- inhibition contribuent à l’ouverture de la molécule et l’exposition des domaines SH3 et du domaine PX respectivement impliqués dans les interactions de la p47phox avec les autres composant de la NADPH oxydase et les lipides membranaires (Ago T et al, 1999). La phosphorylation de la S345 de la p47phox est également observée dans des PN stimulés par le peptide fMLP en absence de TNFα, indiquant qu’en plus de son rôle dans le « priming » des PN, elle jouerait aussi un rôle dans l’activation normale de la NOX2 (Rolas L et al, 2013). D’autres sites de la p47phox sont rapidement phosphorylés dans les cellules stimulées (S304, S315, S320, S328) et contribuent à l’activation de la NOX2 (Belambri SA et al, 2012). L’activation de la NOX2 s’accompagne également de la translocation de la p47phox/p67phox cytosolique vers la membrane plasmique et son interaction avec la p22phox.
b) p67phox
Les travaux de Dusi et collaborateurs (Dusi S et al, 1993) ont identifié pour la première fois l’existence de phosphorylations de la p67phox corrélées à son activation. Le site majeur de phosphorylation ultérieurement identifié se situerait sur la thréonine 223 (Forbes LV et al, 1999), elle se produirait dans le cytosol et précèderait la translocation de la p67phox à la membrane. L’équipe d’accueil a montré l’existence d’autres sites de la p67phox phosphorylés chez les neutrophiles quiescents ou stimulés par le fMLP ou PMA (Dang PM et al, 2003). In vitro, les MAPK recombinantes ERK2 et p38-MAPK ont été capables de phosphoryler la p67phox native. ERK2 a principalement phosphorylé la portion N-terminal de la p67phox alors la portion C-terminale a été principalement phosphorylée par p38-MAPK.
c) La p40phox
L’implication de la p40phox dans l’activation du complexe NADPH oxydase est toujours discutée mais des travaux de Tsynawaki et collaborateurs (Tsunawaki S et al, 1994) ont pu mettre en évidence qu’elle serait impliquée dans l’activation du complexe. Des travaux basés sur l’utilisation de la lignée HL60 ont pu identifier l’existence d’une phosphorylation basale de la p40phox et augmentée de manière corrélée à l’activation de la NADH oxydase suite à la stimulation des cellules (Fuchs et al, 1997). De plus récentes découvertes ont permis d’identifier deux sites de phosphorylation sur la p40phox (Thr-154 et Ser-315) qui seraient dépendants de l’action des PKC
59 durant la stimulation des neutrophiles. Ces phosphorylations inhiberaient les interactions intramoléculaires entre le domaine PX et PB1 et favoriseraient alors l’interaction de la p40phox avec le PI(3)P à la membrane plasmique (Ueyama T et al, 2007).
d) La gp91phox
L’équipe d’accueil a pu mettre en évidence l’existence d’une phosphorylation de la gp91phox dans des neutrophiles stimulés (Raad H et al, 2009). Elle se situerait dans la portion cytoplasmique de la protéine au niveau de la queue C-terminale et serait sensible à l’action des PKC. Trois sites potentiels dans cette portion pourraient être phosphorylés par les PKC : Ser-333, Thr-309 et Ser-550. Les deux premiers sites se situent à proximité du domaine de liaison du FAD tandis que le dernier se situe au niveau du site de liaison du NADPH, ainsi ces phosphorylations pourraient être impliquées dans l’activité diaphorase nécessaire pour la production d’anion superoxyde. Ces travaux ont en outre montré que cette phosphorylation favorise l’interaction de la gp91phox avec la p47phox, p67phox et Rac- 2.
e) La p22phox
De nombreux agonistes ont la capacité d’induire la phosphorylation de la p22phox : Le fMLP, le zymozan ou encore le PMA. Cela impliquerait la phospholipase D et les PKC (Regier DS et al, 2000). Les résultats in vitro montrent en effet que la p22phox est le substrat potentiel de ces deux kinases : Les PKC ( et ) ainsi qu’un substrat de la PLD activé par l’acide phosphatidique « Phosphatidic acid-activated kinase, PAAK ».
3.4.3 Les interactions moléculaires entre les partenaires de la NADPH oxydase
Dans les cellules non stimulées les éléments cytosoliques interagissent entre eux, la p67phox est à la fois associée à la p47phox et la p40phox dans une relation stœchiométrique tandis que Rac 2 reste à part. La gp91phox et la p22phox se situent dans la membrane des granules. La stimulation des neutrophiles entraine une série de changements au niveau des protéines du complexe et une translocation des granules vers la membrane plasmique ou phagosomale, ce qui les enrichit en cytochrome b558. Les protéines cytosoliques sont phosphorylées et leur conformation 3D se modifie. La p47phox est considérée comme l’élément permettant le transport des protéines cytosoliques du complexe, durant l’activation elle se déplie et libère ses domaines SH3 et PX. Le domaine SH3 interagit avec la région riche en proline (PRR) de la p22phox, le domaine PX permet à la p47phox de s’associer avec les phospholipides membranaires tels que le phosphatidylinositol (Ago T et al, 2003). Ainsi, l’ensemble du complexe cytosoliques p47phox-p67phox-p22phox est transporté vers les éléments membranaires gp91phox-p22phox. Il est cependant pas clair si cette translocation nécessite la phosphorylation de la p47phox cytosolique ou se fait via l’interaction du domaine PX ou PH de la60 p47phox avec les phospholipides générés par la PI3-K (Ago T et al, 2003) et la PLD2 (Stahelin RV et al, 2003).
La p67phox et Rac2 jouent un rôle primordial dans l’activation de la gp91phox. Les deux protéines transloquent séparément l’une de l’autre mais se retrouvent associées au niveau de la NADPH oxydase active, Rac2 se liant au domaine TRR se situant dans la partie N-terminale de la p67phox (Lapouge K et al, 2000). Dang et collaborateurs ont mis en évidence in vitro l’existence d’une interaction directe entre p67phox et le cytochrome b
558 au niveau de la gp91phox et qui serait favorisée
par l’interaction entre Rac et p67phox (Dang PM et al, 2002). Cependant, le site précis d’interaction entre p67phox et gp91phox n’est pas encore identifié. De son côté, lorsque la protéine Rac est libérée de son inhibiteur GDI, elle s’associe avec les phospholipides membranaires (Ptdlns(3,4,5)P3) où elle se
trouve à proximité d’une GEF permettant l’échange du GDP contre le GTP et permet l’activation de Rac2 et sa liaison avec la p67phox comme précédemment décrit (revue Pick E et al, 2014). Enfin, outre les interactions entre p40phox et p67phox identifiées dans les neutrophiles au repos, le rôle de la p40phox dans l’activation du complexe reste à approfondir.
Schéma 19 : Interaction entre les éléments de la NADPH oxydase activée (d’après Krause et al 2007)
Les travaux de Dusi et collaborateurs ont montré que l’inhibition des sérine/thréonine kinases par la staurosporine inhibe la production de FRO des neutrophiles stimulés par le fMLP, les phosphorylations des éléments du complexe associé à la membrane mais n’est pas en mesure d’affecter l’association membranaire de p47phox/p67phox induite par le fMLP (Dusi S, Biochem J 1993). A l’inverse, la staurosporine a efficacement réduit l’association membranaire de la p47phox/p67phox induite par le PMA, activateur direct des PKC. L’interaction entre p47phox et p22phox est largement documentée dans des modèles d’activation des PN par le PMA comme nécessaire à l’activation de la NOX2, elle dépend des phosphorylations de la p47phox qui va permettre à l’un des domaines SH3 d’interagir avec le domaine PRR riche en proline de la p22phox (de Mendez I et al,
61 1993). Il serait alors possible d’envisager que parmi la p47phox transloquée à la membrane suite à l’activation des PN par le fMLP, seul le pool phosphorylé participerait à l’accrochage à la p22phox et à l’activation de la NOX2. Réciproquement, sous fMLP l’association de la p47phox à la membrane n’impliquerait pas nécessairement une association avec la p22phox. Ces travaux précurseurs de Dusi et collaborateurs soulèvent donc l’idée d’une translocation de la p47phox depuis le cytosol qui serait séquentielle avec d’un côté une association à la membrane plasmique et de l’autre côté une association avec la p22phox. Or, des observations montrent que la présence de la NOX2 est nécessaire pour l’association de la p47phox et p67phox à la membrane (Leusen JH et al, 1994). Ceci permet alors d’envisager que cette association de la p47phox à la membrane plasmique après stimulation par le fMLP ne dépendrait pas uniquement de l’interaction SH3(p47phox) / PRR(p22Phox) mais qu’elle se réaliserait aussi à un autre endroit du cytochrome b558 et de p47phox ou sur les phospholipides membranaires. A l’opposé, l’activation directe des PKC par le PMA engendre un niveau plus faible de phospholipides, ainsi la translocation membranaire de p47phox/p67phox ne se ferait principalement que via les domaines SH3 de la p47phox vers le PRR de la p22phox.
3.4.4 L’état actif de la NOX2 et la production d’anion superoxyde
La gp91phox est le cœur du complexe NADPH oxydase et responsable de la production d’anion superoxyde. Cette production est finement régulée et nécessite une activation préalable des neutrophiles par des agents solubles ou particulaires comme le facteur du complément C5a, le peptide N-formylé fMLP, le leucotriène B4 (LTB4), le « platelet activating factor » (PAF), les endotoxines bactériennes. Cette activation de la NOX2 est étroitement dépendante de la p67phox et Rac2 et permet à la NOX2 de transférer d’électrons du NADPH vers l’oxygène moléculaire afin de former l’anion superoxyde. Ce transfert d’électron se ferait en deux étapes. La première étape est nommée l’étape diaphorase, la queue C-terminale cytosolique de la gp91phox lie le NADPH et transfert l’électron au groupement héminique via le FAD. La deuxième étape consiste au transfert de cet électron depuis l’hème vers l’oxygène moléculaire afin de former l’anion superoxyde (Raad H et al, 2009).
3.4.5 L’inactivation du complexe et l’arrêt de la production d’anion superoxyde
La production de formes réactives de l’oxygène est une fonction nécessaire pour éliminer l’agent agresseur mais qui peut devenir délétère si elle perdure dans le temps. Plusieurs mécanismes sont donc mis en œuvre afin de mettre un terme à cette production et permettre d’enclencher la réparation tissulaire une fois l’agent pathogène éliminé. Cette désensibilisation fait appel à une internalisation des récepteurs à 7 domaines transmembranaire qui avaient été stimulés, à l’inhibition, par les phosphatases, des phosphorylations des éléments de la NADPH oxydase. La p47phox en particulier est sensible à ces déphosphorylations. En effet, la PKA et l’AMPc sont capables de réduire les phosphorylations de la p47phox (Bengis-Garber C et al, 1996).62 D’autres mécanismes sont également impliqués dans cette désensibilisation de la NADPH oxydase. Il a par exemple été montré que l’association de la p47phox et de la p67phox avec le cytochrome b558 était transitoire. L’arrêt de l’activité de la NADPH oxydase est corrélé avec une diminution de l’association du complexe p47phox-p67phox à la membrane plasmique (DeLeo FR et al, 1999). Enfin des modifications au niveau de la gp91phox et p22phox sont également possibles. Cela pourrait faire intervenir des phosphorylations, mais aussi des dégradations protéolytiques. Ces hypothèses font l’objet de la 2ème partie de notre étude expérimentale.