A MPLIFICATION DE L ’ADN GENOMIQUE : PCR

Le mélange réactionnel, les volumes ainsi que les programmes utilisés pour amplifier l’ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) sont fonction du type de marqueur employé.

2.4.1. MARQUEURS SNP

Le polymorphisme des marqueurs SNP a été révélé en utilisant le protocole KASP

(Kompetitive Allele Specific PCR) (http://www.lgcgenomics.com). Des amorces

KASP « KASP assays » développées à partir des séquences publiées sur gènes causals ont été utilisées pour distinguer les allèles dominants et récessifs aux loci Rht-B1, Rht-D1, Vrn-A1,

Exon7_C/T_Vrn-A1, Vrn-D1, Ppd-B1 et Ppd-D1 (Dreisigacker et al., 2016b). La PCR a été

conduite en utilisant un volume réactionnel total de 5 µl contenant 2.5 µl d'eau, 2.5 µl 2 x KASPar Reaction mix, 0.07 µl Assay mix et 30 ng d'ADN séché (Tableau 37). Les calculs des volumes de Master Mix et Assay Mix nécessaires pour effectuer la réaction de l’ensemble des échantillons pour chaque marqueur sont effectués en utilisant l’application ‘‘Customer KASP reaction volume calculator’’ (Figure 31). L’ADN des échantillons étudiés, des témoins positifs

et négatifs, de l’eau (contrôles) en plus du mélange réactionnel sont placés dans des puits des plaques PCR (384 puits/plaque) à l’aide de micropipette Multi Channel modèle Eppendorf. Les contrôles positifs, négatifs et neutres sont répétés deux fois.

Tableau 37. Composition du mélange réactionnel pour constituer le KASP mix à 96 puits (5 ul de volume final, méthode d’ADN sec) de Rht-B1, Rht-D1, Vrn-A1, Exon7_C/T_Vrn-A1, Vrn-

D1, Ppd-B1† et Ppd-D1 (Dreisigacker et al., 2016b).

Réactif 5 μl Rht-B1 Rht-D1 Vrn-A1 Exon7_C/T_Vrn-A1 Vrn-D1 Ppd-D1

ADN N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

2X KASP reaction Mix 2.5 740 400 880 1200 1000 600

Assay Mix 0.07 20.4 20.4 24.2 33 27.5 16.5

H2O 2.5 793.6 429 943.8 1287 1072.5 643.5

†

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Figure 31. L’application ‘‘Customer KASP reaction volume calculator’’utilisée pour calculer les volumes réactionnels nécessaires pour PCR/SNP (Dreisigacker et al., 2016b).

L’amplification par PCR est lancée dans le Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems) par un démarrage à chaud à 94°C pour 15 min suivi de 11 cycles de 20 s à 94°C, 60 s à 65°C et 30 s à 72°C, suivis de 26 cycles de 20 s à 94°C, 60 s à 57°C et 30 s à 72°C. La fluorescence a été lue à un point de lecture final à 20 °C après une phase d’élongation de 2 min à 72°C (Tableau 38). Après amplification par PCR, les plaques de 384 puits contenant les échantillons sont ensuite lues à la température ambiante sur un lecteur de fluorescence spécifique, le Pherastar Plus (BMG Labtech). Les résultats ainsi obtenus servent pour générer des graphiques spécifiques aux SNPs. Le système KASP adopté utilise les fluorophores FAM et VIC pour distinguer les génotypes à des longueurs d'onde d'excitation de 485 nm et 534 nm, et d'émission de 520 nm et 560 nm, respectivement. Les génotypes hétérozygotes sont indiqués par HET. Les génotypes sont ensuite déterminés après avoir représenté graphiquement les données des FAM et VIC, respectivement sur les axes x et y. Le logiciel Klustercaller, version 2.21 (LGC Genomics, Hoddeson, UK) est utilisé à cet effet. Dans le cas de la présente étude, tous les allèles dominants aux loci Rht-B1, Rht-D1, Vrn-A1, Vrn-D1, Ppd-B1 et Ppd-D1 sont

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de type VIC, alors que les allèles récessifs sont de type FAM. La base azotée C au locus

Exon7_C/T_Vrn-A1 est associé à l’allèle FAM alors que la base T est liée au fluorophore VIC

(Dreisigacker et al., 2016b).

Tableau 38. Profil d’amplification par PCR aux loci Rht-B1, Rht-D1, Vrn-A1, Exon7_C/T_Vrn-

A1, Vrn-D1, Ppd-B1† et Ppd-D1 (Dreisigacker et al., 2016b).

94°C pour 15 minutes Démarrage à chaud : activation de l'enzyme

94°C 65°C 72°C pour pour pour 20 secondes 60 secondes 30 secondes 11 cycles 94°C 57°C 72°C pour pour pour 20 secondes 60 secondes 30 secondes 26 cycles 72°C pour 2 minutes 20°C Température finale †

: Marqueur écarté lors du criblage des populations F4 vue l’absence d’allèle dominant au locus Ppd-B1 chez les parents.

2.4.2. MARQUEURS STS

Les STS sont des marqueurs PCR. Ils sont relativement courts et utilisent des séquences spécifiques facilement amplifiables par PCR (200 à 500 pb) et détectables en présence de toutes les autres séquences génomiques cartographiées dans le génome. Ils produisent un motif simple et reproductible sur gel d'agarose ou de polyacrylamide. Dans la plupart des cas, les STS sont co-dominants, c’est-à-dire permettent de distinguer les individus homozygotes et hétérozygotes

(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/probe/docs/techsts/). L’ADN génomique est amplifié en

utilisant des amorces spécifiques (Tableau 36) suivant le protocole développé pour l’amplification des marqueurs STS et adopté par le CIMMYT (Dreisigacker et al., 2016b). Le mélange réactionnel nécessaire pour l’amplification de toutes les amorces par PCR contient dans les 10 ul par réaction individuelle les concentrations finales suivantes : 1X Buffer avec colorant vert (Promega Corp., USA), 200 μM deoxynucléotide triphosphates, 1.5 mM de chlorure de magnésium, 0.25 μM de chaque amorce, 1U de l’ADN polymérase (GoTaq®Flexi, Promega Corp., Cat. # M8295) et 50 ng de l’ADN (Tableau 39). Ce mélange réactionnel est donc fonction du nombre d'échantillons qui seraient amplifiés par PCR. Le profil d’amplification optimisé pour le marqueur STS Vrn-B1 utilisé dans cette étude est : 94°C pour 2 min suivi de 30 cycles of 94 °C pour 1 min, 50-68°C pour 2 min et 72°C pour 2 min (Tableau 40). La PCR est lancée dans l’appareil Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

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Tableau 39. Composition du mélange réactionnel pour PCR/STS du marqueur Vrn-B1 (Dreisigacker et al., 2016b).

Réactif [Finale] 10 μl RXN Vrn-B1

H2O --- 0.05 μl 210 μl

5X Green ou Colorless GoTaq®Flexi 1X 2.0 μl 1200 μl

25 mM MgCl2 1.5 mM 0.6 μl 360 μl

dNTP Mix (2.5 mM chacune) 200 μM 0.8 μl 480 μl

Amorces F + R (1.0 μM chacune) 0.25μM chacune 2.5 μl 1500 μl

Go taq(® DNA Polymerase (5U/μl) 0.25 U 0.05 μl 30 μl

ADN (10-50 ng/μl) 50-100 ng 4.0 μl 4 μl

Tableau 40. Profil d’amplification par PCR au loci Vrn-B1 (Dreisigacker et al., 2016b).

94°C pour 2 minutes 94°C 50-68°C 72°C pour pour pour 1 minute 2 minutes 2 minutes 30 cycles

72°C pour 5 minutes 1 cycle

15°C Température finale

Les produits amplifiés ont été séparés et mis en évidence sur un gel d’agarose à 1.5%. Le produit de la PCR est coloré avec du bromure d’éthidium dans 1X TBE buffer, visualisé et photographié sous la lumière ultraviolette par le FirstLight UV transilluminator (UVP BioDoc- It 220 Imaging System). Les images ainsi obtenues sont traitées par le logiciel Picasa, version 3.9.141.259. Les génotypes porteurs d’allèles dominants et récessifs sont ensuite différenciés après le score des bandes.