M ARQUEURS MOLECULAIRES

Les marqueurs utilisés dans la présente recherche décrivent la hauteur des plantes, la précocité à l’épiaison et le type d’adaptation saisonnière. Deux types de marqueurs sont utilisés : les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) qui appartiennent aux marqueurs moléculaires de la dernière génération et les marqueurs STS (Sequence Tagged Site). Sept KASP assays de

gènes importants ont été extraits de la base de données Cerealsdb

(www.cerealsdb.uk.net/cerealgenomics/CerealsDB/Excel/MAS_data_May_2013.xls) et

sélectionnés des rapports publiés. Deux SNPs liés à la hauteur de la plante, deux liés à la photopériode et trois liés à la vernalisation sont utilisés (Tableau 35). Un marqueur STS lié à la croissance et au développement de blé est employé (Tableau 36). Ces marqueurs sont testés pour leur absence/présence chez les lignées parentales. Seul l’ADN des populations, dont l’un

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des deux parents porte le gène d’intérêt, est amplifié par PCR et les lignées descendantes sont ensuite criblées pour détecter le polymorphisme.

2.3.1. VARIATIONS DUES AUX RHT-1 ET RHT-2

Rht-B1b et Rht-D1b sont respectivement les formes dominantes des gènes de réduction

de la hauteur Rht-1 et Rht-2 (chromosomes 4B et 4D, respectivement) (Ellis et al., 2002). Un génotype de blé est de type demi-nain quand-t-il contient l’un de ces deux allèles. La présence simultanée de ces deux formes dans un même fond génétique induit le nanisme (forme mutante de l’haplotype sauvage). Les allèles récessifs Rht-B1a et Rht-D1a sont répandus chez les génotypes de blé à paille haute (forme sauvage).

Des marqueurs simples ont été utilisés pour détecter des mutations ponctuelles aux loci

Rht-B1 et Rht-D1. Les mutants (Rht-B1a) à Rht-B1 ont été cartographiés en utilisant le

marqueur wMAS000001 qui détecte le SNP causal de la stature demi-naine. De même, un seul marqueur, wMAS000002 a été utilisé pour détecter le polymorphisme Rht-D1 qui est associé à la même stature (Tableau 35). Dans le cas de la présente recherche, les génotypes Krichauff et Pavon76 sont utilisés comme des témoins. Krichauff porte les allèles Rht-B1b et Rht-D1a, alors

que Pavon76 porte les allèles Rht-B1a et Rht-D1b.

2.3.2. VARIATIONS DUES AUX VRN-A1,VRN-B1 ET VRN-D1

Chez le blé héxaploïde, les besoins de vernalisation sont principalement contrôlés par des allèles à trois loci orthologues, Vrn-A1, Vrn-B1 et Vrn-D1 (chromosomes 5A, 5B et 5D, respectivement). Les allèles dominants du gène Vrn-A1 sont désignés comme Vrn-A1a, Vrn-

A1b et Vrn-A1c. La forme récessive de ce gène est indiquée par vrn-A1 (Yan et al., 2004b ;

McIntosh et al., 2014). De même, les allèles dominants aux loci Vrn-B1 et Vrn-D1, sont désignés par Vrn-B1a et Vrn-D1a et les formes récessives par vrn-B1 et vrn-D1, respectivement (Fu et al., 2005 ; McIntosh et al., 2014).

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Tableau 35. Description des marqueurs SNP testés pour leur polymorphisme chez les lignées parentales et les populations F4 étudiées (Dreisigacker et al., 2016b).

Trait SNP id Gène Marqueur Amorce FAM Amorce VIC Amorce commune Dominance Allèle FAM Allèle VIC Référence

Haute ur wMAS000001 Rht-B1 Rht-B1_SNP CCCATGGCCATCT CSAGCTG CCCATGGCCATCTC SAGCTA TCGGGTACAAGGT GCGGGCG Co- dominant Sauvage (Haut) Demi-nain Ellis et al. (2002) wMAS000002 Rht-D1 Rht-D1_SNP CATGGCCATCTCG AGCTRCTC CATGGCCATCTCGA GCTRCTA CGGGTACAAGGTG CGCGCC Co- dominant Sauvage (Haut) Demi-nain Ellis et al. (2002) Verna li sa ti on

wMAS000033 Vrn-A1 Vrn-A1_9K0001

AGAGTTTTCCAA AAAGATAGATCA ATGTAAAT GAGTTTTCCAAAAA GATAGATCAATGTA AAC GTTAGTAGTGATGG TCCAATAATGCCAA A Co-

dominant Type hiver

Type printemps

Yan et al. (2004b)

wMAS000039 Vrn-D1 Vrn-D1-D1a_A ATCATTCGAATTG

CTAGCTCCGG

ATCATTCGAATTGC TAGCTCCGC

GCCTGAACGCCTA

GCCTGTGTA Dominant Type hiver

Type printemps

Yan et al. (2004b)

Vrn-A1 Exon7_C/T_Vrn-A1 gagtttgatcttgctgcgccG ctgagtttgatcttgctgcgccA cttccccacagctcgtggagaa Co- dominant Floraison précoce Díaz et al. (2012) Photopéri

ode wMAS000024 Ppd-D1 TaPpdDD001

CAAGGAAGTATG AGCAGCGGTT AAGAGGAAACATG TTGGGGTCC GCCTCCCACTACAC TGGGC Co-

dominant Sensible Insensible

Beales et

al. (2007)

wMAS000028 Ppd-B1 TaPpdBJ003 CGTGAAGAGCTAG

CGATGAACA

TGGGCACGTTAACA

CACCTTT Dominant Insensible

Beales et

al. (2007)

Tableau 36. Description du marqueur STS testés pour la présence de polymorphisme chez les lignées parentales et les populations F4 étudiées

(Dreisigacker et al., 2016b).

Trait Gène Marqueur Allèle Taille du produit Dominance Forward Reverse Reference

Vernali sat ion Vrn-B1 Intro 1/B/F/R3/R4 Printemps : Vrn-B1, Hiver : vrn-B1 Vrn-B1 = 709 pb, vrn-B1 = 1149 pb Co-dominant CAAGTGGAACGGTTAGGA CA CTCATGCCAAAAATTGA AGATGA Fu et al. (2005)

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Les variétés de blé d'hiver ont besoin d'une exposition prolongée au froid pour induire la floraison, c’est le processus de la vernalisation. Ces variétés sont porteuses des allèles récessifs aux différents loci suscités. La présence de l’une des formes dominantes de ces allèles élimine l’effet des autres formes récessives et rend ainsi le cultivar insensible à la vernalisation, il est de type printemps. Ce type n’a pas d’exigence de traitement au froid ou vernalisation.

L’allèle Vrn-A1b a été différencié des allèles Vrn-A1a et vrn-A1 en utilisant le marqueur co-dominant wMAS000033 (Tableau 35). La présence de SNP pour Vrn-A1 a été testée en utilisant Siete Cerros et Pavon76 comme des témoins. Siete Cerros porte l’allèle dominant Vrn- A1a, tandis que Pavon76 porte l’allèle récessif vrn-A1. Un marqueur SNP supplémentaire

nommé Exon7_C/T_Vrn-A1 est évalué pour déterminer le polymorphisme dans une autre position de l’allèle Vrn-A1 (Tableau 35). Les génotypes Bagula et Tonichi sont les témoins utilisés pour tester la présence d'un SNP à ce locus. Bagula est de type ‘Claire’ à floraison précoce, alors que Tonichi est de type ‘Hereward’ à floraison tardive.

Les allèles dominants au loci Vrn-B1, sont désignés comme Vrn-B1a, Vrn-B1b et Vrn-

B1c alors que la forme récessive est indiquée par vrn-B1 (Fu et al., 2005). Un marqueur STS

co-dominant spécifique Intro 1/B/F/R3/R4 est utilisé pour déterminer le type d’allèles présent dans les lignées étudiées (Tableau 36). Les témoins porteurs de ces allèles et utilisés dans la présente étude sont, respectivement, Siete Cerros (1235/709 pb), Bagula (1199 pb et 673 pb), Paragon (849 pb) et Anza (1149 pb).

Les allèles de printemps (Vrn-D1a) et d'hiver (vrn-D1) au loci Vrn-D1 sont différenciés en utilisant un marqueur dominant unique wMAS000039 (Tableau 35). Par ailleurs, les cultivars Pastor, porteur de l’allèle dominant du type printemps et Yipti, porteur de l’allèle récessif du type hiver, sont les témoins employés pour détecter la variation au niveau de cet allèle.

2.3.3. VARIATIONS DUES AUX PPD-B1 ET PPD-D1

Beales et al. (2007) ont spécifié les principaux loci de la réponse à la photopériode. Les allèles dominants Ppd-B1a et Ppd-D1a provoquent une insensibilité à la photopériode et les allèles récessifs Ppd-B1b et Ppd-D1b entrainent la sensibilité à ce phénomène. Pour cela, nous avons utilisé deux marqueurs SNP : wMAS000028 et wMAS000024 aux loci Ppd-B1 et Ppd-

D1, respectivement (Tableau 35). Le premier est dominant alors que le second est co-dominant.

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photopériode, respectivement au Ppd-B1 et Ppd-D1. Par contre, Pavon76 et Chinese Spring sont

les témoins porteurs d’allèles récessifs dans le même ordre.