II.1 Matériel et méthodes
II.1.3 Modifications chimiques des nanocristaux de cellulose sulfatés
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alcalines. Après retour à la température ambiante, les groupements OD à l'intérieur du cristal ne sont plus accessibles et seuls les OD de surface pourront à nouveaux être convertis en OH.
La deutération partielle est effectuée sur les linters de coton avant leur hydrolyse à l'acide sulfurique. Typiquement, 10 g de linters de coton sont dispersés dans une solution de
soude 0,1 M dans D2O puis introduits dans un autoclave. L'autoclave est plongé dans un bain
d'huile à 210 °C pendant 1 h. Après refroidissement, les linters sont redispersés dans l'eau déionisée puis filtrés sur Büchner. Cette opération est répétée 5 fois. Les linters deutérés humides sont ensuite hydrolysés selon la méthode précédemment décrite en tenant compte de la quantité d'eau qu'ils contiennent dans la préparation de la solution d'acide sulfurique. La réussite de la réaction peut être contrôlée par spectroscopie infrarouge en suivant l'apparition
des bandes caractéristiques des OD dans la région située entre 2300 et 2500 cm-1
, soit 1000 cm-1
plus bas que les bandes OH.
II.1.3 Modifications chimiques des nanocristaux de cellulose
sulfatés
II.1.3.1 Oxydation TEMPO
Le but de cette réaction est d’oxyder les groupements hydroxyles primaires de surface des nanocristaux de cellulose en groupements acide carboxylique. Une partie de la suspension de NCC sulfatés (5 g de cellulose soit 0,0308 mol) est dispersée dans 500 mL d’eau distillée et agitée. Du bromure de sodium (0,5 eq/mol d’anhydroglucose soit 1,588 g) est ensuite introduit ainsi que le catalyseur TEMPO (0,028 eq/mol soit 135 mg). Après agitation, la solution d’hypochlorite de sodium (1 eq/mol) est ajoutée goutte à goutte. Le pH est maintenu entre 10 et 10,5 par ajout de NaOH 0,5 M. Lorsque le pH se stabilise (après environ 2 h), la réaction est arrêtée en ajoutant environ 15 mL de méthanol. La suspension devient alors laiteuse. Une fois la réaction arrêtée, la suspension est centrifugée pendant 30 min à 11200 tr/min. Le surnageant limpide est récupéré et les culots sont repris avec de l’eau distillée. Cette opération est encore répétée 3 fois tout en ajoutant du NaCl de façon à avoir une concentration 0,5 M dans le but de faciliter la séparation complète entre le culot des nanocristaux et le surnageant. Après la dernière centrifugation, les culots sont redispersés dans de l'eau et placés sous dialyse dans l'eau déionisée.
II.1.3.2 Couplage peptidique
II.1.3.2.a. Polyétheramines Jeffamines®
Comme nous l'avons présenté dans l'introduction, notre choix s'est porté sur le greffage de chaînes de polymères thermosensibles de la famille des polyétheramines Jeffamines®. Ces polymères nous ont été gracieusement fournis par la société Huntsman. Notre étude a porté sur des polymères de la série M qui sont des copolymères statistiques d’oxyde d’éthylène et d’oxyde de propylène qui possèdent une fonction amine en bout de chaîne. La structure chimique des Jeffamines est présentée sur la figure II.2.
Figure II.2. Structure chimique des polyétheramines Jeffamine®.
Nous avons utilisé différents polymères de cette série qui se distinguent par différentes valeurs des nombres de groupements oxyde d'éthylène (x) et oxyde de propylène (y), ce qui conduit à différentes masses molaires des chaînes mais également à différentes LCST. Les différents polymères utilisés ainsi que leurs propriétés sont présentées dans le tableau II.1. Il est intéressant de constater que pour une masse moléculaire sensiblement équivalente, les Jeffamines M2005 et M2070 possèdent des LCST très différentes. A température ambiante, le polymère M2005 est hydrophobe (conditions de mauvais solvant dans l'eau) alors que le polymère M2070 est hydrophile (conditions de bon solvant).
Tableau II.1 Propriétés des différentes polyétheramines Jeffamines® utilisées.
Jeffamine® Mw (g/mol) OE/OP (x/y) T° de
trouble (°C) Etat physique Insoluble dans : M600 600 1/9 45-65 liquide - M1000 1000 19/3 ~ 80 solide cyclohexane M2005 2005 6/29 14-18 liquide DMSO M2070 2070 31/10 ~75 liquide cyclohexane
Chapitre II – Matériel, méthodes et techniques de caractérisation
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II.1.3.2.b. Couplage peptidique dans l’eau
Dans un ballon bicol, nous introduisons 100 mL d’une suspension de NCC oxydés TEMPO dans l’eau. Nous ajoutons X équivalents de polymère par mole d'acide carboxylique. Nous ajustons le pH entre 7,5 et 8 puis nous ajoutons Y équivalents d’EDAC et Z équivalents de NHS par mole d'acide carboxylique après dissolution des réactifs dans 2 mL d’eau. Les valeurs X, Y et Z que nous avons fait varier sont regroupées dans le tableau III.1 et discutées dans le chapitre correspondant. Le pH est maintenu entre 7,5 et 8 par ajout de HCl 0,5 M pendant 24 h. Une fois la réaction arrêtée, le pH de la suspension est abaissé entre 1 et 2 par ajout de HCl 0,5 M. La suspension est ensuite centrifugée à 11200 tr/min pendant 15 min. Le culot est repris dans de l’eau désionisée. Cette opération est répétée deux fois. Après la dernière centrifugation, le culot est redispersé dans de l'eau et la suspension est mise en dialyse dans l’eau distillée.
II.1.3.2.c. Couplage peptidique dans le DMF
Pour tester l’effet du solvant sur le rendement du couplage peptidique, nous avons dispersé les NCC oxydés TEMPO dans le DMF par une méthode d’échange de solvant avec l’acétone puis avec le DMF. 100 mL d’acétone ont été ajoutés à une suspension de NCC oxydés TEMPO (50 mL, 1% (m/m)). Le mélange a été agité pendant 30 min puis centrifugé à 11200 tr/min à 4°C. Après élimination du surnageant, le culot a été redispersé dans 50 mL d’acétone et agité pendant 30 min. Cette opération est répétée 3 fois puis le culot est dispersé dans 50 mL de DMF anhydre, agité pendant 1 h puis soniqué pendant 4 min. Nous obtenons finalement une suspension stable. Pour la réaction de couplage dans le DMF, nous avons utilisé le même protocole que celui dans l’eau décrit dans le paragraphe précédent à deux différences près : pas d’ajustement de pH et mise en dialyse directement dans l’eau sans centrifugation.
II.1.3.3 Oxydation au métaperiodate
Cette réaction consiste à remplacer les fonctions hydroxyles secondaires présentes sur les atomes de carbone 2 et 3 de la cellulose par des fonctions aldéhydes avec rupture de la liaison C2-C3. Elle est effectuée par l’action du métaperiodate de sodium, ajouté dans la suspension de NCC à l’abri de la lumière et à température ambiante. Pour préparer nos suspensions oxydées, nous prenons une certaine masse de suspension initiale contenant 100
mg de cellulose et nous y ajoutons une quantité de NaIO4 correspondant à 1,3 équivalent/mole
d’anhydroglucose. La masse de NaIO4 est pesée dans un bécher, puis nous additionnons la masse de suspension désirée. Le bécher est ensuite bouché avec du parafilm et recouvert d'aluminium (le periodate de sodium est photosensible: décomposition en NaIO3 et O2). Le tout est placé sous agitation durant le temps d’oxydation désiré. Enfin, la solution est transvasée dans 8 tubes adaptés à l'ultracentrifugeuse. Une centrifugation à 40000 tr/min (118000 g) à 4 °C pendant 30 min est alors effectuée. Cette étape permet d'éliminer l'excès de periodate dans le surnageant, ce qui arrête complètement la réaction d’oxydation. Tous les culots sont ensuite redispersés dans l’eau déionisée et dialysés.
II.1.3.4 Amination réductrice
L’amination réductrice consiste en la formation d’une liaison amine stable entre les NCC et les Jeffamines par réaction des fonctions aldéhydes issues de l’oxydation au métaperiodate avec la fonction amine primaire à l’extrémité des polymères. Nous ajoutons une quantité de polymère égale à 4 équivalents/mole d’aldéhyde, la masse de suspension
nécessaire pour avoir 0,4 g de cellulose, 4 équivalents de NaBH3CN (réducteur) et, pour finir,
un volume de tampon phosphate à pH 6,3 égal au volume de la suspension de NCC. Cette réaction est mise sous agitation durant 72 h. Les solutions sont ensuite placées dans 8 tubes à ultracentrifugation et nous effectuons un cycle de centrifugation à 40000 tr/min pendant 30 min à 4 °C. Les culots sont récupérés dans de l'eau distillée et mis sous agitation. Dès lors que nous obtenons une solution homogène, nous la plaçons en dialyse.