II.2 Techniques de caractérisation
II.2.10 Microscopie électronique en transmission
Figure II.7. Polariseurs en positions parallèles et croisées.
Les observations par microscopie optique à lumière polarisée ont été effectuées sur des suspensions introduites dans des capillaires plats en verre (Microslides VitroCom Inc), de
dimensions intérieures 0,2×2×50 mm3, qui sont ensuite scellés à la flamme. Nous avons
utilisé un microscope Zeiss Axiopot 2 équipé d’un polariseur et d’un analyseur croisés. Il possède trois objectifs de grandissement 2,5×, 10×, et 40×. Les images sont acquises sous forme numérique au moyen d’une caméra CCD ColorView12 de SIS, pilotée par le logiciel AnalySIS. L’observation des suspensions avec la MOLP nous a permis de suivre l’évolution et la texture de la phase anisotrope, et de mesurer sa fraction volumique par rapport au volume total de la suspension. Les observations à fort grossissement (40×) nous ont également permis de déterminer les pas cholestériques.
II.2.10 Microscopie électronique en transmission
II.2.10.1 Principe
La microscopie électronique en transmission (MET) permet d'observer des échantillons à une échelle nanométrique. Un faisceau d'électrons fortement accélérés (typiquement 80-200 keV) traverse un spécimen très mince (quelques centaines de nm d'épaisseur au maximum). Un système de lentilles électromagnétiques permet de contrôler la trajectoire des électrons et de former sur un écran fluorescent une image très agrandie du volume projeté de l'échantillon. Cette image peut être enregistrée sur une plaque photo ou numérisée au moyen d'une caméra CDD. L'interaction des électrons avec la matière conduit à
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différents phénomènes d'absorption, de diffusion ou de diffraction qui sont à l'origine de contrastes dans les images :
- le contraste de diffusion : les objets épais ou composés d'atomes lourds diffusent plus fortement les électrons que les spécimens minces ou légers. L’insertion d’un diaphragme d'objectif ne laissant passer que les électrons transmis par l'échantillon et éliminant une certaine proportion d'électrons diffusés génère des contrastes dans l'image entre les objets épais/lourds, qui apparaîtront sombres, et ceux minces/légers, qui apparaîtront clairs.
- le contraste de diffraction : certains électrons incidents sont déviés par les plans atomiques des échantillons cristallins selon des angles définis par la loi de Bragg. Si le diaphragme d’objectif ne sélectionne que les électrons transmis par le spécimen, les objets cristallins en position de Bragg apparaissent en sombre.
- le contraste de phase : des interférences sont générées aux interfaces entre des zones du spécimen de différents indices de réfraction des ondes électroniques. L’intensité, le contraste (sombre ou clair) et la distribution des franges de Fresnel ainsi formées dépendent de la focalisation de la lentille objectif, contrôlée par l'opérateur.
Les polysaccharides étant composés d'atomes légers, ils n'engendrent qu'un faible contraste de diffusion. Le contraste de phase joue donc un rôle très important. Les échantillons cristallins, tels que les nanocristaux de cellulose, sont essentiellement visibles grâce au contraste de diffraction. Cependant, durant l'observation et l'enregistrement des images, du fait de leur grande sensibilité, leur cristallinité diminue rapidement sous irradiation.
II.2.10.2 Appareillage et modes d’imagerie
L’observation par MET a été effectuée à l’aide d’un microscope Philips CM200 'Cryo', fonctionnant à une tension de 80 kV (Figure II-8b). Les échantillons ont été observés sous faible illumination (ou "low dose") afin de limiter les dégâts d'irradiation. Les images ont été enregistrées sur des plaques photo Kodak SO163.
II.2.10.3 Préparation des échantillons
Nos échantillons se présentent sous la forme de suspensions plus ou moins diluées de NCC. Pour les observer par MET, on laisse une gouttelette de suspension diluée sécher sur un
mince film de carbone amorphe transparent aux électrons. Deux problèmes se présentent alors. D'une part, les NCC étant de faible volume et constitués d’atomes légers (C, H, O), ils n'engendrent qu'un contraste très faible vis-à-vis du support de carbone. D'autre part, ils sont particulièrement sensibles à l'irradiation électronique et se dégradent rapidement dès lors qu'on les observe à fort grossissement. Pour limiter ces problèmes, une technique de préparation spécifique a été utilisée pour renforcer le contraste : la coloration négative. Une autre technique, la cryomicroscopie (cryo-MET), s'appuyant sur la congélation ultra-rapide des échantillons, a été utilisée pour observer des suspensions diluées tout en s'affranchissant des effets de séchage.
II.2.10.3.a. Prétraitement des grilles carbonées
Les grilles de cuivre utilisées en MET sont recouvertes d'un mince film-support de carbone amorphe. Ce carbone est généralement hydrophobe, ce qui empêche une bonne distribution des objets sur sa surface. Un traitement préalable est possible. L'effluvage, aussi appelé "glow discharge", consiste à placer les grilles carbonées dans une enceinte en présence d'une très faible pression d'air. Une haute tension est appliquée entre deux électrodes. L'air est ionisé et les ions "décapent" la surface du film, laissant des charges résiduelles. L'effluvage dure environ 30 s. La suspension à étudier peut être ensuite déposée sur la surface décapée.
II.2.10.3.b. La coloration négative
On utilise une solution aqueuse à 2 % d'un sel d'atomes lourds (acétate d’uranyle). Une goutte de suspension est tout d’abord déposée sur une grille de MET préalablement rendue hydrophile par effluvage. Après 1 min, l’excès de liquide est absorbé lentement avec du papier filtre. Avant séchage, on dépose une goutte de colorant. Après 1 min, on absorbe l'excès de colorant et on laisse l'échantillon sécher. Un mince dépôt de colorant s'est formé sur le carbone et vient souligner les contours des objets. Ceux-ci apparaissent donc en clair sur un fond plus foncé et la coloration est dite "négative".
II.2.10.3.c. La cryomicroscopie électronique en transmission
La cryo-MET a été développée afin d’observer des objets dont la morphologie ou la
structure dépendent de l'hydration ou de l'environnement liquide.164,165
Cette technique permet alors d'observer ces objets dispersés dans un mince film de glace vitreuse. Le principe de la
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Figure II.8. Principe de la congélation rapide pour la cryomicroscopie (d’après Durrieu et
al., 2004).166
Une goutte de suspension est déposée sur une membrane de carbone à trous (films "lacey" NetMesh, Pelco). La grille est montée sur la guillotine d'un appareil de congélation ultra-rapide Leica EMCPC. L’excès de liquide est absorbé à l’aide d'un papier filtre (Figure II-8a, étape 1) et la grille est immédiatement plongée dans l’éthane liquide refroidi à -171°C par de l’azote liquide (Figure II-8a, étape 2). L’échantillon est alors monté sur un porte-objet Gatan 626 refroidi par de l'azote liquide. Le tout est transféré à froid dans le microscope et observé en conditions de faible illumination, à -180°C.