Modèles structuraux

Les six domaines transmembranaires rencontrés chez la gp91^phox, tout comme les sites catalytiques impliqués dans l’activité, peuvent être considérés comme une trame commune partagée par l’ensemble des homologues, y compris les ferriques réductases de levures ou de plantes supérieures. Malgré une telle homologie, un système commun de régulation de ces différentes enzymes est peu probable. Pour illustrer l’ensemble de ces caractéristiques, un modèle structural est proposé pour chacune des isoformes (Figure 29). La sous-unité gp91^phox du complexe NADPH oxydase rencontré chez les cellules phagocytaires, telles que les neutrophiles, est représentée ; sont également figurées les représentations schématiques des membres de la famille Nox et de la famille Duox, les ferrique réductases membranaires qui partagent des similitudes fortes avec les NADPH oxydases, et enfin le modèle consensus obtenu pour les algues rouges à partir des études de séquences précédemment décrites.

A. gp91^phox des cellules phagocytaires cytoplasme gp91phox (Nox2) cytoplasme cytoplasme gp91phox (Nox2)

B. Homologues à la gp91^phox des cellules non-phagocytaires

cytoplasme Nox1 Nox3 Nox4 cytoplasme Nox5 3 sites de fixation de Ca2+ cytoplasme Nox1 Nox3 Nox4 cytoplasme Nox1 Nox3 Nox4 cytoplasme Nox5 3 sites de fixation de Ca2+ cytoplasme Nox5 3 sites de fixation de Ca2+

C. Dual oxidase (Duox)

cytoplasme domaine peroxydase 2 sites de fixation de Ca2+ cytoplasme domaine peroxydase 2 sites de fixation de Ca2+

D. Respiratory burst oxidase homologue (rboh) chez les plantes

cytoplasme cytoplasme

E. Ferrique réductase membranaire

cytoplasme cytoplasme

F. Respiratory burst oxidase homologue (rboh) des algues rouges

cytoplasme cytoplasme

Figure 29 : Schémas structuraux de la sous-unité gp91phox de la NADPH oxydase de neutrophiles et de ces homologues chez divers organismes.

Les domaines transmembranaires sont représentés enchâssés dans la membrane. Les paires d’histidine impliquées dans la fixation des hèmes et les sites de fixation du FAD et du NADPH sont figurés respectivement par un losange et deux étoiles. Les sites de fixation du calcium sont figurés par des ovales noirs.

A. La gp91phox des cellules phagocytaires. La NADPH oxydase chez les cellules phagocytaires est un complexe enzymatique dont l’unité catalytique est la gp91phox (ou Nox2). La sous-unité membranaire p22phox et l’association de facteurs cytosoliques sont nécessaires à l’activation du complexe.

B. Homologues à la gp91phox des cellules non-phagocytaires. Ce sont les membres de la famille Nox : Nox1, 3 et 4, similaires à la gp91phox, et Nox5, séquence la plus divergente et ayant la particularité de posséder 3 sites de fixation du calcium sur son extension N-terminale.

C. Dual oxidases chez les mammifères et les nématodes. Elles possèdent un domaine peroxydase et des sites de fixation du calcium en N-terminal, en plus du domaine homologue à la gp91phox. D. Homologues à la NADPH oxydase des plantes supérieures, ou rboh. Deux sites de fixation du

calcium sont systématiquement présents sur une extension N-terminale.

E. Ferriques réductases membranaires, rencontrées chez les levures et plantes supérieures. La présence d’un domaine transmembranaire supplémentaire en N-terminal par rapport à la gp91phox est probable.

F. Homologues à la NADPH oxydase chez les algues rouges : Ccrboh, Pyrboh, Cmrboh1 et Cmrboh2. Quatre domaines transmembranaires supplémentaires sont présents entre les 2 sites de fixation du NADPH par rapport à la gp91phox.

Chez les algues rouges de fortes homologies ont été identifiées entre les séquences

étudiées : Ccrboh chez C. crispus, Pyrboh chez P. yezoensis, Cmrboh1 et Cmrboh2 chez l’unicellulaire C. merolae. L’analyse de ces séquences et leurs particularités nous

permet de proposer un nouveau modèle structural de NADPH oxydase spécifique à

cette lignée. Les six domaines transmembranaires identifiés chez la gp91^phox et ses

homologues sont conservés, tout comme les sites catalytiques. En revanche la zone d’insertion d’environ 300 acides aminés, présente entre les deux sites de fixation du NADPH, influence vraisemblablement le repliement de la protéine à travers la membrane. La première partie de ce fragment est cytosolique, la seconde portant probablement quatre domaines transmembranaires additionnels.

De telles particularités sont absentes au niveau des séquences homologues de diatomées : Tprboh1 et Tprboh2 chez T. pseudonana et Ptrboh1 et Ptrboh2 chez P.

tricornutum. D’un point de vue structural, elles ressembleraient davantage aux membres de la famille Nox qu’aux isoformes d’algues rouges.

Par ailleurs, aucun homologue à la sous-unité membranaire p22^phox, ou aux facteurs cytosoliques de régulation p47^phox, p60^phox et p67^phox, n’a été identifié dans les banques de données chez ces mêmes algues.

Les processus de régulation des homologues de NADPH oxydases chez l’ensemble des organismes vivants sont très probablement différents. Chez les mammifères, seul la mise en place du complexe actif de la NADPH oxydase phagocytaire est particulièrement bien documentée. Chez les membres de la famille Nox, l’intervention d’unités cytosoliques ou membranaires est certainement requise mais peu documentée (Bokoch et Knaus, 2003), excepté pour Nox4 qui semble être active en absence de tels composés (Banfi et coll., 2001). La régulation directe de Nox5 par le calcium a clairement été établie (Banfi et coll., 2001), ainsi que chez les homologues de plantes supérieures (Keller et coll., 1998) qui possèdent également des domaines de fixation du calcium en N-terminal.

L’alcalinisation extracellulaire et l’influx de calcium accompagnent généralement la production de FAO, à la fois chez les mammifères et les plantes supérieures (Simon-Plas et

coll., 2002 ; Yoshioka et coll., 2003 ; Zhao et coll., 2005). Chez la tomate, Sagi et Fluhr

(2001) ont montré que l’activité NADPH oxydase était stimulée par le calcium d’une manière dose-dépendante. Chez la pomme de terre des chélateurs du calcium bloquent

calciques l’inhibent totalement (Yoshioka et coll., 2001). Chez l’algue brune Fucus

serratus le calcium semble détenir un rôle important dans la mise en place du burst oxydatif par des rhizoïdes soumis à un stress hyper-osmotique (Coelho et coll., 2002). Chez l’algue rouge C. crispus la production de formes actives de l’oxygène est abolie en présence d’inhibiteurs de canaux calciques, tandis qu’elle est stimulée par des ionophores de calcium, suggérant également un rôle majeur du calcium dans la mise en place du

burst oxydatif chez l’algue rouge (Bouarab, 2000).

Des processus de phosphorylation et de déphosphorylation, au même titre que les influx calciques, semblent être indispensables à la stimulation des activités de type NADPH oxydase chez l’ensemble des organismes vivants. En effet les phosphorylations

directes des composés cytosoliques dans l’activation du complexe NADPH oxydase sont avérées chez les cellules phagocytaires (Leusen et coll., 1996 ; Vignais, 2002). Chez les plantes supérieures, plusieurs sites potentiels de phosphorylation par la protéine kinase C ont été identifiés sur la séquence AtrbohD d’A. thaliana. Chez ce modèle l’activité NADPH oxydase est par ailleurs stimulée par des activateurs de protéines kinases (Desikan

et coll., 1998). Chez la pomme de terre, des inhibiteurs de protéines kinases bloquent

l’accumulation du transcrit StrbohB (Yoshioka et coll., 2001), et de la même façon l’expression du gène NbrbohB chez le tabac est induite par des protéines kinases

(Yoshioka et coll., 2003). Chez l’algue rouge C. crispus le burst oxydatif est également aboli par la staurosporine, un inhibiteur général de protéines kinases, tandis que des inhibiteurs spécifiques (PD98059, apigénine), sont sans effets sur la production de FAO, tout en inhibant la mise en place de la résistance à l’infection chez les gamétophytes

(Bouarab, 2000). Un tel comportement suggère que des étapes de phosphorylation et

déphosphorylation de protéines sont également indispensables à la production du burst oxydatif chez l’algue rouge, mais également au niveau de la mise en place d’autres

I.5 Analyses phylogénétiques de la NADPH oxydase et de ces