Effets du MeJA sur l’induction de gènes chez C. crispus

réactions de défense chez les gamétophytes de C. crispus, ainsi que l’observation de sa néosynthèse in vitro, nous avons voulu connaître l’effet d’un tel traitement sur l’induction des gènes présentés précédemment. Nous avons donc réalisé une cinétique de traitement des algues par 100 µM de méthyle jasmonate pendant 48 heures, avec des prélèvements après 0, 1, 6, 12, 24 et 48 heures. Nous avons également testé l’effet de l’oxylipine dérivée de l’acide linoléique (C18:2), le 13-oxo-ODE, dont la synthèse in vivo est également attribuée à une activité de type 13-lipoxygénase.

L’analyse par Northern blotting à porté sur les différents gènes candidats présentés précédemment (à l’exclusion des bromoperoxydases) et dont les enzymes sont potentiellement impliquées dans des voies de métabolisme des acides gras ou de leurs dérivés. Ainsi l’effet de ces traitements a été étudié sur 7 gènes : la myéloperoxydase

CcMPO3, la peroxiredoxine CcPrx1, les cytochromes P450 CcCYPt1 et CcCYPp1, les glutathion S-transférases CcGST1, CcGST2 et CcGST7. L’actine a été utilisée en tant que gène contrôle de l’expression. La Figure 43 présente les résultats obtenus pour l’ensemble des 7 gènes. L’observation des profils d’expression des témoins non traités montre que les algues étaient sans doute stressées au moment du traitement (temps 0 heure), puis à partir de 24 heures, ceci du fait que les algues n’ont sans doute pas été pré-incubées assez longtemps dans leur milieu de culture avant traitement d’une part, puis du fait qu’elles aient dû faire face à une diminution du volume d’eau de mer par évaporation à la fin de la cinétique d’autre part. L’observation des différents profils entre eux permet néanmoins de tirer quelques conclusions.

Sur les 3 clusters codant des myéloperoxydases chez C. crispus, seule l’expression de CcMPO3 a pu être étudiée. Le gène CcMPO1 n’a pas été détecté dans aucune des conditions testées, malgré un témoin positif correct. La sonde spécifique du gène CcMPO2 ne s’est quant à elle pas hybridée ni sur les filtres, ni sur le témoin. La sonde spécifique de

CcMPO3 a permis d’identifier un transcrit d’environ 2 300 pb, confirmant que la

séquence de 1 316 pb que nous possédons est largement incomplète. L’expression de

CcMPO3 est visiblement induite après 1 à 12 heures de traitement par le méthyle

Le gène de la peroxiredoxine CcPrx1 est assez fortement exprimé de façon

constitutive, et semble être légèrement induit dans le cas d’un traitement par le méthyle

jasmonate alors que le 13-oxo-ODE semble sans effet. L’analyse par Northern blotting a permis l’identification d’un transcrit d’environ 1 000 pb, ce qui est en accord avec la séquence pleine-longueur de 928 pb que nous avons déjà identifiée.

Les résultats obtenus pour les deux gènes de cytochromes P450, CcCYPt1 et

CcCYPp1 sont plus difficiles à interpréter, l’induction des deux gènes étant difficile à

corréler au stress provoqué par les traitements chimiques. En effet les deux gènes sont déjà fortement exprimés dans les témoins en début de cinétique (0 heures), ainsi qu’en fin de cinétique (24 et 48 heures). Ces fortes expressions sont retrouvées dans les algues traitées, excepté à 48 heures pour CcCYPp1 dans le cas du méthyle jasmonate. La forte expression à 6 heures pour CcCYPt1 dans les algues témoins n’est en revanche pas retrouvée dans les traitements par les oxylipines. La forte expression du gène CcCYPt1 à 1 et 12 heures de traitement par le méthyle jasmonate pourrait en revanche être assimilée à une réponse au traitement. Lorsqu’il est induit le gène CcCYPt1 est toujours plus fortement exprimé

que le gène CcCYPp1. Les séquences nucléiques dont nous disposons par ailleurs sont

largement incomplètes par rapport aux transcrits de 1 700 et 2 600 pb observés au niveau des Northern blottings pour respectivement CcCYPt1 et CcCYPp1. L’expression du troisième gène de cytochrome P450 CcCYPt2, caractéristique de la famille des stérols 14α-déméthylases, n’a malheureusement pas pu être étudiée au cours de ces analyses, compte tenu de problèmes technique liés à la banque d’EST.

L’expression des 3 clusters de glutathion S-transférases a également été étudiée par Northern blotting. Les transcrits de CcGST1 et CcGST2 ont une taille d’environ 900 pb, ce qui est en accord avec la taille des séquences de 854 et 958 pb dont nous disposons par ailleurs. D’autre part les sondes utilisées ne permettent pas d’hybridation croisée des 2 transcrits. Le transcrit CcGST7 a une taille plus importante d’environ 1 100 pb, ce qui est en accord avec la séquence isolée de 1 036 pb. Les deux premiers gènes CcGST1 et

CcGST2 sont déjà assez fortement exprimés de façon constitutive dans l’algue

(témoins à 1, 6 et 12 heures). CcGST7 est quant à lui plus faiblement exprimé. En revanche

les trois gènes sont fortement induits par un traitement au méthyle jasmonate, et plus

faiblement dans le cas du 13-oxo-ODE. L’effet du méthyle jasmonate est particulièrement important dans le cas de CcGST2 après 6 et 12 heures.

CcMPO3 2 300 pb CcPrx1 1 000 pb CcCYPt1 1 700 pb CcCYPp1 2 600 pb CcGST1 900 pb CcGST2 900 pb CcGST7 1 100 pb actine

témoins MeJA 13-oxo-ODE

0 1 6 12 24 48 0 1 6 12 24 48 0 1 6 12 24 48 heures CcMPO3 2 300 pb CcPrx1 1 000 pb CcCYPt1 1 700 pb CcCYPp1 2 600 pb CcGST1 900 pb CcGST2 900 pb CcGST7 1 100 pb actine

témoins MeJA 13-oxo-ODE

0 1 6 12 24 48 0 1 6 12 24 48 0 1 6 12 24 48 heures

Figure 43 : Profils d’expression de 7 gènes de défense chez C. crispus, après traitement par deux oxylipines en C18

Les gamétophytes de C. crispus ont été incubés avec du méthyle jasmonate et du 13-oxo-ODE et prélevés après différentes périodes de traitement. Les gamétophytes laissés dans l’eau de mer constituent les témoins d’expression au cours de la cinétique. Des sondes spécifiques ont été utilisées pour la myéloperoxydase

CcMPO3, la peroxiredoxine CcPrx1, les deux cytochromes P450 CcCYPt1 et CcCYPp1, ainsi que pour les trois glutathion S-transférases CcGST1, CcGST2 et CcGST7. L’actine a été utilisée comme gène constitutif.

II.6 Bilan de l’identification moléculaire de gènes de défense