Les myéloperoxydases

Les myéloperoxydases, tout comme les peroxydases d’éosinophiles, ovoperoxydases, ou autres peroxydases de type animal, sont rencontrées chez les mammifères, les insectes, les nématodes et certaines bactéries. Elles sont impliquées dans la formation de formes actives halogénées de l’oxygène en utilisant les ions superoxyde libérés par la NADPH oxydase pour produire de l’hypochlorite HOCl, cinquante fois plus toxique que le peroxyde d’hydrogène. Les 3 clusters identifiés dans les banques d’EST

de C. crispus présentent de très fortes similitudes avec les peroxydases animales et possèdent notamment les sites strictement conservés chez ces enzymes. Les gènes de

myéloperoxydases chez C. crispus font partie des gènes les plus moyennement à fortement exprimés dans les banques d’EST.

Le 1^er cluster (CcMPO1) est constitué de 12 EST provenant de la banque de thalles de gamétophytes, contrairement aux deux autres clusters construits à partir d’EST de la banque de protoplastes. La séquence de 910 pb est incomplète. La 1ère méthionine est rencontrée au 25ème codon, et il n’y a pas de codon stop. La séquence protéique putative est incomplète en C-terminal et serait complète en N-terminal avec 278 acides aminés. Elle possède entre 25 et 30 % d’identité avec des séquences de myéloperoxydases de

Le second cluster (CcMPO2) est constitué de 10 EST provenant de la banque de protoplastes. La séquence de 1 675 pb est incomplète. La 1^ère méthionine est rencontrée au 11^ème codon, et il n’y a pas de codon stop. La séquence protéique putative est pratiquement complète en C-terminal et complète en N-terminal avec 548 acides aminés. Elle possède entre 30 et 40 % d’identité avec les myéloperoxydases de mammifères et des peroxydases de la bactérie marine Rhodopirellula baltica. Considérant les parties alignables, CcMPO2 partage 47 % d’identité et 60 % de similitude avec CcMPO1.

Le dernier cluster (CcMPO3) est constitué de 5 EST provenant de la banque de protoplastes. La séquence de 1 316 pb est incomplète. La 1^ère méthionine est rencontrée au 63^ème codon, et il y a 6 codons stop sur la partie 5’. Il y aurait des incertitudes de séquençage sur les 1ères bases de la séquence, compte tenu que le 1^er codon est un stop alors que la séquence protéique putative est largement incomplète en N-terminal. En revanche elle serait complète en C-terminal, avec 392 acides aminés. Elle possède entre 30 et 35 % d’identité avec les peroxydases d’éosinophiles, les myéloperoxydases de mammifères et des peroxydases de la bactérie marine Rhodopirellula baltica. Considérant les parties alignables, CcMPO2 partage 48 % d’identité et 65 % de similitude avec CcMPO1, contre 49 % et 68 % respectivement avec CcMPO2.

Trois singletons présentant des variations de séquences ont également été identifiés dans la banque de protoplastes. Les séquences sont beaucoup plus courtes car largement incomplètes, avec 870, 474 et 877 pb, avec des cadres ouverts de lecture de 289, 147 et 247 acides aminés respectivement. Ces séquences présentent entre 25 et 40 % d’identité avec des myéloperoxydases présentes dans les banques de données publiques, et entre 25 et 65 % d’identité avec les 3 clusters déjà identifiés chez C. crispus.

CHAINE LEGERE CHAINE LOURDE

PEPTIDE SIGNAL POLYPEPTIDE EXCISE LORS DE LA MATURATION

PEPTIDE EXCISE Gln His distale Asp Asp Arg Glu His proximale Asn

site de fixation du calcium

CcMPO3 . . . . HsMPO HsMPO 87 R L R S G S A S P M E L L S Y F K Q P V A A T R T A V R A A D Y L H V A L D L L E R K L R S L W R R P F N V T D V L T P A Q L N V L S K S S G C A Y Q D V G V T C P E Q D K HsEPO 61 R L R S G S A S P M D L L S Y F K Q P V A A T R T V V R A A D Y M H V A L G L L E E K L Q P Q R S G P F N V T D V L T E P Q L R L L S Q A S G C A L R D Q A E R C S . . D K CcMPO1 30 . . . D A D E L N P I E P N S P E F I D R E R R N C . R I E CcMPO2 31 . . . D G E D Q G P V D A G T A V F D G R M G L N C A E E E CcMPO3 . . . . T T T T T T T T T T HsMPO HsMPO 173 Y R G C N N P G S W P K N I V T L M W T I T M R R S . . . T L A N R A F V R L P A E Y E D G F S L P Y G W T G V R N G F P V A L A R A V S E R F P D Q T P D Q E R S L F M Q HsEPO 145 Y R G C N N P G S W P R N I V N L M W T I T R K R R . . . L L A N Q A L A R L P A E Y E D G L S L P F G W T S R R N G F L L P L V R A V S Q R F P E R T S D R G R A L F M Q CcMPO1 56 F R G C T N P G T Y P R S I L T I M F R V D A I G S K R Q L W S N R P H F T F N G L S S . . V V A T G K N L S P R . . . I N C K Q R N F D R R S L N E T T I CcMPO2 58 F R G C T N P G T Y P R S I V T V L F R F D A R A T L R Q L F S R L P Q F S F G R R S S D R I R D N V R S L S P L . . . I N A K Q M D R E R R G L N E V T F CcMPO3 . . . . HsMPO HsMPO 256 S N S D G Q L D H L T P E V P P L I N I K F F R I I L T V A L D D F E P A A R A S F V T G V N C T S C Q Q P C F K P P D P R N Q A D C I P C P A C P G S N I T R N Q A F S M HsEPO 228 S N S D G Q I D H L S P E A P P I I N I K F F R V I L T V A F D D F E S P A R V A F T A G V D C R T C Q L P C F K P P D P R N Q R D C I P A P S C P Q N K N R R N Q A F S M CcMPO1 129 S N S D G Q I D H L T P E I P P L A T L K F F R V L T L L F T V A V N D D . . . P M F K M E N D F N M . . E . . . E R V K V V R G S R E R P Q S A V S CcMPO2 133 S N S D G Q I D H L T P E I P P M A T L R F F R I L T L L F T V A V N N G A S E D G E T V P R P F F D V E D D L N I G G Q . . . R R A T V E E R S T E V R P S L D S CcMPO3 1 S N S D I I S L L . . . G A A G G R P P P G V D . . . E R P A H V A A HsMPO HsMPO 342 V Y G L R L L F G D R E P L H R E H N N N L G L P N L H T L A S T M T L L L A S E E P L A R N M S Q G L L A V N Q R F Q D N R A F D D D P C L N R S A R I P C T S M E S L R HsEPO 314 V Y G L R L L F G D R E P L H R E H N N N L G L P N L H T L A T M T L F M L A S E V S L S L R R T Y G L L A I N Q R F Q D N R A F D D D P C L N R S A R I P C T S T K A A R CcMPO1 196 V Y G L R L L F G D R E P L H R E H N S N L P L N A R N I N T V T L F L I A P N E G R L K V F R G . . . M E T G G N I L N . . . . N A P Q N R K S F T H A H V S S CcMPO2 212 V Y G L R L L F G D R E P L H R E H N T L L P S M R N V A N T I T I F L I A A S E E R A G F N S G G . . . M R V G R N N Q N . . . . S E P R L D R K F L S H M S D CcMPO3 30 V Y G L R L L F G D R E P L H R E H N S P I P M N V A T L V F L L S N Q I R Q D V E P G C K . . . L R T G G D V N F D . . . . S V P L P S D Q F V P A N V A V D C HsMPO HsMPO 428 E L P L E L Y Q A R I A Q I D Y P L V G K L P Y R S P I V F T A F R G H T L I M R T K S N R W D G R E K V G M V I T Y R L L P T A M R Y T S Y N D V D R A N . N Y Q P F F L HsEPO 400 E L P L D L Y N A R I A Q I D F P L V G R L G Y R N P V V F T A F R G H T M L M R T R R N R W N G K E K M G M V I T Y R L L K A R A R T H G Y C S V D R A N . L F Q P F F L CcMPO1 270 E L P A K Q A F G . . . . CcMPO2 286 E L P E L Y Q A R I A Q I E W P A I G R L P W R N P V L F T A F R G H T L V V R T Q T T F D F N D R T Q N I Q F K V F D Y T . . . R L R F Q A V D A S V S A I N N V S Q CcMPO3 104 E L P A D L F Q A R I A Q I E Y P A I G K L P F R T P V V F T A F R G H T M V I R D E A F D M G Q E N K N G Q F K V L E Y V . . . D R R V S I T R D L D S A V G N V A R HsMPO HsMPO 513 V L S F F G I D L R G A K L N I A I R L F Q V I G D L A N M Q R S R D H LD N R Y Q P M E P N P R P R V A S W R V V L E G P I L M T P A R Q N Q V D E E R E M R . . L P L G HsEPO 485 V L S F F G I D L R G A K L N M L L R L F Q V I G D L A N M Q R S R D H LD S Q Y R A S A P N S H P S A A S W R I V Y E G P I L M T P A R Q D A V D E D R R R R . . L A L G CcMPO1 . . . . CcMPO2 367 L L Q F F G I D L R G A R A Q M V L R L F N V A G D L A N L Q R S R D H VR S G N R N M R P . . . T D T S N V N L I L N T S F . . A N T E V D L V D A N F T N G D . L I L G CcMPO3 185 I M T F F G A E I R G A K A Q M V L R L F N V I G D L A N L Q R S R D H LG P G N S V L P S . . . P D T R V A S R F . . E E F . . T Q I E I D L N N N N F T P A N F F I F A HsMPO HsMPO 597 P Y N V Q V L Y G T I D I W M G V E V G P L I F L R D G D F W W G A W R R F C G L P Q P E T G L G T L R N L K A R K L M E Q P N N G S P L K R K G R L A C I G T Q R K R E N HsEPO 569 P Y N L Q V L Y G T I D I W I G I E V G P L L F A R D G D F W W G A W R R F C G L S Q P R N A L S R L K N Q D A R K F L N L P D N A A P L L P G A R L A C F E N Q R R R Q K CcMPO1 . . . . CcMPO2 447 P Y N A T I V Y G S V E A W I G M E M G P M I F I R D G D F Y Y F D V R . . A R F R R G N R R F A D T R N T N Q S A L Q T A V D N L A D K P R V S S T L A W V R E I R S E N CcMPO3 264 P F T A S I V Y G T V E A W I G V E M G P M I F L R D G D F F F S E I Q . . . E L M G M R K T F A D S S V A N Q S G L Q N V V D R L A D H E S G S S T N A W E R Q S V R R N HsMPO HsMPO 683 F L I I E G V S M Q Q R Q A A Q S L P R I I C D N T G I T T V S K N N F M S N S Y P R D F V N C S T L P A L N L A S W R E A S HsEPO 655 F L I I R G V T K R Q R K A S R S L S R I I C D N T G I T T V S R . D F R A N I Y P R G F V N C S R I P R L N L S A W R . G T CcMPO1 . . . CcMPO2 531 Y V L I M S Q D P E V L A N P R R . . . A . . . CcMPO3 347 F I V L R N V S S Q M R S A P R N . . . A F T E S E I F R S L I L R N T N I A S S E L P N R I F F A A A B B HsMPO HsMPO T T T T T T T T HsMPO T T T T T T T HsMPO T T . HsMPO T T T T HsMPO T T T T T T HsMPO HsMPO

L’alignement présenté en Figure 39 permet d’apprécier les similitudes des séquences les plus complètes identifiées chez C. crispus avec celles d’une myéloperoxydase et d’une peroxydase éosinophile humaines, ainsi qu’avec celle d’une peroxydase de Rhodopirellula baltica. Ces enzymes sont des homodimères où chaque monomère est lui même constitué d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère. La structure secondaire du monomère est majoritairement composée d’hélices α. Le cœur central contenant les hèmes est constitué de 5 hélices α, quatre provenant de la chaîne lourde et la dernière de la chaîne légère (Furtmuller et coll., 2006). Les deux chaînes sont codées par un même polypeptide précurseur qui est ensuite excisé. Le monomère de la myéloperoxydase mature est obtenu après le clivage du peptide signal et excision du polypeptide précédant la chaîne légère en N-terminal, ainsi que d’un court fragment peptidique situé entre les deux chaînes (Figure 39). Les séquences du monomère avant maturation seraient plus courtes chez l’algue rouge (environ 590 acides aminés contre 745 pour HsMPO), en raison de la présence d’un domaine N-terminal restreint : le polypeptide excisé lors de la maturation est ainsi beaucoup plus court que celui rencontré chez la myéloperoxydase humaine (en moyenne 45 acides aminés contre 125). En revanche les deux chaînes légères et lourdes seraient de tailles équivalentes.

Les résidus histidine impliqués dans la fixation covalente de l’hème sont conservés chez les séquences de C. crispus : l’histidine distale située sur la chaîne légère (His134 et His138 respectivement pour CcMPO1 et CcMPO2), ainsi que l’histidine proximale située sur la chaîne lourde (His356 et His174 respectivement pour CcMPO2 et CcMPO3). L’asparagine située en C-terminal de la chaîne lourde (Asn437 et Asn254 pour respectivement CcMPO2 et CcMPO3) est reliée à l’histidine proximale par une liaison hydrogène et interviendrait dans la stabilisation du dimère. La glutamine située à proximité de l’histidine distale est typiquement rencontrée chez les peroxydases de type animale et absente de la cavité distale des peroxydases des plantes supérieures (Furtmuller et coll., 2006), or un tel résidu est également présent chez les séquences de C. crispus CcMPO1 (Gln130) et CcMPO2 (Gln134). L’arginine située sur la chaîne lourde est également importante pour l’établissement de cette cavité et est absolument conservée chez les 3 séquences de l’algue rouge (Arg247, Arg263 et Arg81 respectivement pour CcMPO1, CcMPO2 et CcMPO3), de même pour le résidu glutamate situé en aval (Glu250, Glu266 et Glu384 respectivement pour CcMPO1, CcMPO2 et CcMPO3). En revanche au niveau du site de fixation du calcium seuls 4 résidus sont conservés chez CcMPO1 (Leu187, Thr188,

Ser189, Asp192) et CcMPO2 (Leu203, Thr204, Ser205, Asp208) contre les huit habituellement rencontrés (Leu, Thr, Ser, Phe, Val, Asp, Ala, Ser). La conservation pour ce site est encore plus faible pour CcMPO3 avec deux résidus conservés (Ser23, Asp26), mais l’information de séquence étant incomplète en N-terminal, l’alignement pourrait être amené à changer avec la séquence pleine longueur. Au niveau de la chaîne légère le résidu aspartate situé en amont de l’histidine distale est conservé chez CcMPO1 (Asp133) et CcMPO2 (Asp137). Il jouerait également un rôle de ligand du calcium tout en facilitant les interactions entre les deux chaînes du monomère. Le résidu aspartate suivant est quant à lui remplacé par un résidu thréonine chez CcMPO1 (Thr135) et CcMPO3 (Thr139).

L’identification de myéloperoxydases chez C. crispus constitue la première mise en évidence de ces enzymes chez les végétaux. Elles pourraient avoir une activité de défense par production de composés toxiques. Outre leur rôle d’oxydation des halogénures et de génération de formes actives de l’oxygène, les myéloperoxydases ont également un rôle dans la peroxydation des lipides chez les mammifères, essentiellement à partir d’acides gras en C18 et C20 (acides linoléique et arachidonique). Elles pourraient être impliquées dans de telles fonctions chez l’algue rouge C. crispus, compte tenu que de tels précurseurs y sont naturellement présents.

II.3 Enzymes à activités anti-oxydantes : cas de la