Etudes immunologiques et enzymatiques

Pour compléter les données de biologie moléculaire, nous avons également entrepris des études biochimiques et immunologiques de l’enzyme native. La détection de bandes d’activité de type NADPH oxydase et/ou l’utilisation d’anticorps spécifiquement dirigés contre la protéine déduite sur des extraits protéiques de l’algue nous auraient permis d’assigner la présence de la (des) protéine(s) de type NADPH oxydase dans ces extraits. Le microséquençage des bandes d’intérêt issues des études sur gels aurait pu nous permettre d’établir une correspondance entre le gène Ccrboh identifié et les protéines isolées dans les extraits, avec éventuellement assignation d’une activité de type NADPH oxydase.

Dans un premier temps j’ai essayé d’identifier la protéine Ccrboh dans des extraits bruts ou membranaires, à l’aide d’anticorps spécifiques. Connaissant la séquence déduite de Ccrboh, nous avons fait synthétiser des peptides caractéristiques de cette séquence, pour permettre l’obtention d’anticorps spécifiques (le protocole d’obtention est décrit dans la section Matériel et méthodes et a été réalisé par Eurogentec). Le premier anticorps est dirigé contre la zone comprise entre les acides aminés 280 et 295, qui correspond au site de fixation du FAD. Le second anticorps est dirigé contre la partie soluble de la zone d’insertion présente entre les deux sites de fixation du NADPH et entre les acides aminés 489 et 504. Malheureusement les expériences de western blotting menées par la suite ne

nous ont pas permis d’identifier l’enzyme Ccrboh dans les extraits protéiques de l’algue rouge. Aucune bande majeure n’est détectée dans les extraits de thalles. Certaines

bandes discrètes sont détectées dans quelques extraits mais le fort bruit de fond fait suspecté une détection de bandes aspécifiques. Les extraits membranaires ne permettent pas un enrichissement de ces protéines, les bandes n’étant plus détectées. Pour remédier à ce problème nous avons fait l’hypothèse que l’expression de l’enzyme était induite au cours d’épisodes de stress tels que la génération de protoplastes. Les cellules produisent alors de grandes quantités de FAO, certaines d’entre elles pouvant être relarguées suite à des activités de type NADPH oxydase. J’ai donc par la suite effectué ces mêmes analyses sur des extraits protéiques de protoplastes de gamétophytes. Si aucune bande n’est observée dans le culot de protoplastes, assez curieusement deux bandes de faible taille (35

fragments pariétaux (Figure 37A). La taille des bandes ainsi que leur détection systématique avec les deux anticorps est en désaccord avec les données de séquences dont nous disposons par ailleurs. En effet la séquence code une protéine putative de 93 kDa. La taille réelle peut être plus importante si des modifications post-traductionnelles, telles que des glycosylations, ont lieu. Dans le cas où la protéine aurait été clivée spécifiquement à un endroit au cours de l’extraction, la somme des deux bandes (75 kDa) reste malgré tout inférieure à la taille attendue. Par ailleurs, additionner la taille des deux bandes est un processus logique uniquement si chaque anticorps, dirigé contre deux zones distinctes, ne détecte qu’une seule des deux bandes ; or, pris individuellement, la détection des deux bandes est systématique.

L’absence de détection dans des extraits protéiques totaux ou membranaires, la mise en évidence de deux bandes dans le compartiment apoplastique, à des tailles non-conformes avec celles attendues, nous amène à émettre des réserves sur le fait que ces bandes correspondent à la Ccrboh de C. crispus. L’utilisation d’anticorps anti-peptides explique sans doute la difficulté à détecter la protéine cible, dont les fragments sont peut-être masqués par le repliement.

Par la suite les résultats d’activité sur gel n’ont ni confirmé ceux du western

blotting, ni permis de fournir une réponse claire sur la mise en évidence de l’enzyme.

Le protocole de détection de l’activité NADPH oxydase sur gel a été adapté de la méthode décrite par Sagi et Fluhr (2001). Tout comme dans le cas du western blotting, je me suis confrontée à la difficulté d’extraire des protéines membranaires chez un organisme riche en polysaccharides tel que l’algue rouge. Les composés sont certainement mal séparés, les protéines membranaires pénétrant alors difficilement dans les gels natifs d’acrylamide. Si les tests d’activités sur gel natif permettent la détection d’une bande plus au moins nette, ils nous apparaissent peu convaincants (Figure 37B). Le protocole de détection des activités sur gel dénaturant après régénération des protéines ne nous a pas permis de mettre en évidence une activité du même type à partir des mêmes extraits. De plus, la réalisation d’un western blotting à partir des gels d’activités n’a pas donné lieu à la détection de bandes, que ce soit dans le cas des gels natifs ou dénaturants.

_ _ _ _ _ _ 214,0 118,0 92,0 52,2 35,7 28,9 M ^{1 2 3 4 5 6}

1 : témoin sans NADPH 2 : + SOD 100 U/mL 3 : + SOD 50 U/mL 4 : essai sans inhibiteur 5 : + DPI 5 µM 6 : + DPI 10 µM A. B. _ _ _ _ _ _ 214,0 118,0 92,0 52,2 35,7 28,9 M _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 214,0 118,0 92,0 52,2 35,7 28,9 214,0 118,0 92,0 52,2 35,7 28,9 M ^{1 2 3 4 5 6}

1 : témoin sans NADPH 2 : + SOD 100 U/mL 3 : + SOD 50 U/mL 4 : essai sans inhibiteur 5 : + DPI 5 µM 6 : + DPI 10 µM

1 2 3 4 5 6

1 : témoin sans NADPH 2 : + SOD 100 U/mL 3 : + SOD 50 U/mL 4 : essai sans inhibiteur 5 : + DPI 5 µM 6 : + DPI 10 µM

A. B.

Figure 37 : Etudes immunologiques et biochimiques de l’enzyme native.

A. Analyse par Western blotting du milieu de digestion de protoplastes de C. crispus.

Des anticorps spécifiques de Ccrboh furent utilisés. Le marqueur de taille (M) indique la taille des bandes obtenues.

B. Analyse sur gel, d’activités de type NADPH oxydase dans des extraits protéiques de C. crispus. Le protocole utilise la précipitation du NBT présentée par Sagi et Fluhr (2001). L’activité est inhibée par la superoxyde dismutase et le DPI.

Au final les études immunologiques et biochimiques ne nous ont pas permis ni de mettre en évidence la présence de l’enzyme Ccrboh dans les extraits, ni celle de protéines ayant une activité de type NADPH oxydase. Actuellement nous ne pouvons pas établir de correspondance entre le transcrit Ccrboh de C. crispus et sa protéine dans les extraits de l’algue.