Modèles Fonctionnels

Un des objectifs de l’approche biomimétique est de mettre en relation structure et activité de l’enzyme afin de synthétiser des catalyseurs qui conduiront à une meilleure compréhension au niveau moléculaire des facteurs qui contrôlent la réduction tétraélectronique de l’oxygène en eau.

En 1997, l’équipe de Collman a publié le premier modèle fonctionnel de la cytochrome c oxydase capable de fixer irréversiblement le dioxygène à pH physiologique, avec un rapport

molaire de 1:1 (Figure 11).¹⁰³ Ce système associe une porphyrine de Cobalt(II) et un chapeau

triazacyclononane (TACN) permettant la coordination du cuivre. Les deux sites de complexation sont reliés par des liaisons amide permettant de maintenir la distance cobalt-cuivre entre 4.5 et 5.5 Å. Ce modèle comporte une base axiale de type imidazole imitant

Figure 11: Premier modèle fonctionnel de la CcO à pH physiologique.¹⁰³

Afin d’étudier le comportement biomimétique des modèles hème/cuivre, l’électrocatalyse sur électrode rotative «disque-anneau» s’est révelée être une méthode de choix. L’électrode, qui sert à la fois de support de catalyseur et de donneur d’électrons est formée d’un disque de graphite entouré d’un anneau de platine (Figure 12).

Figure 12 : Schèma d’une électrode rotative «disque-anneau» (RDE).104

Le principe de cette technique est basé sur l’adsorption des catalyseurs insolubles dans l’eau sur le disque de graphite, puis l’introduction cet ensemble dans une solution aqueuse saturée en dioxygène et tamponnée à un pH proche des valeurs physiologiques. Le potentiel de l’anneau est fixé de façon qu’il puisse réoxyder en oxyène les espèces partiellement réduites du dioxygène, tandis que le potentiel du disque est balayé afin de déterminer le potentiel de réduction de l’oxygène. L’efficacité du catalyseur pour la réduction de l’oxygène en eau est déterminée en fonction de la quantité du d’espèces partiellement réduites

formées.¹⁰¹

Le complexe Co(II)-Cu(I) du modèle (1-Co) montre en électrocatalyse une réduction tétraélectronique du dioxygène en eau avec production négligeable d’espèces partiellement réduites (peroxyde d’hydrogène). Cependant les études d’électrocatalyse réalisées sur les complexes 1-Co(II) sans cuivre et Co(II)-Cu(I) en absence de la base axiale proximale révèlent une réduction à deux électrons du dioxygène en peroxyde d’hydrogène. Ces résultats suggèrent que l’atome de cuivre et la base axiale sont directement impliqués dans la réduction à quatre électrons par ce modèle. Bien que ce modèle contienne un atome de cobalt au lieu d’un atome de fer comme dans le système naturel, il est connu que le comportement de ces deux atomes vis-à-vis de l’oxygène est similaire.

De manière surprenante, le modèle Fe(II)-Cu(I) (1-Fe) analogue du composé (1-Co) (Figure 13) entraîne une réduction diélectronique du dioxygène avec production de peroxyde

d’hydrogène.¹⁰⁵ Cette différence de réactivité a été expliquée en termes de différence de

potentiel d’oxydoréduction du fer et du cobalt. Dans le complexe de cobalt, le potentiel du couple Co(III)/Co(II) est plus élevé que le potentiel Cu(II)/Cu(I) et donc la réduction du cobalt se produit avant celle du cuivre, tandis que dans le complexe de fer, le potentiel du couple Fe(III)/Fe(II) est moins élevé que celui du Cu(II)/Cu(I), ce qui provoque probablement la fixation du dioxygène sur le cuivre au lieu du fer et il en résulte une réduction diélectronique.

Figure 13: Modèle à chapeau TACN avec une base azotée en position axiale.

Afin de bénéficier d’un modèle Fe(II)-Cu(I) permettant une réduction tétraélectronique du dioxygène en eau, le chapeau TACN a été remplacé par un chapeau

Tribenzyl-tris(aminoethyl)amine (TBTren). Le nouveau modèle (2) (Figure I.14) ainsi obtenu permet

dans les conditions physiologiques de réaliser une réduction tétraélectronique du dioxygène

en eau.¹⁰⁶

Bien que les spectres RMN des modèles 1 et 2 révèlent un couplage antiferromagnétique,

indiquant la formation d’un pont μ-peroxo entre les centres métalliques (Fe^III-(O2^2-)-Cu^II), les

études de l’électrocatalyse montrent une réactivité différente avec l’oxygène. Ces résultats indiquent donc l’influence de l’environnement distal sur l’état peroxo formé et montrent notamment le rôle important du potentiel redox du cuivre dans la distinction de la réduction diélectronique ou tétraélectronique de l’oxygène. Dans le chapeau TACN, le cuivre(I) est coordonné par trois atomes d’azote, ce qui rend l’état oxydé cuivre(II) moins stable que celui du chapeau TBTren, où il est coordonné avec quatre atomes d’azote. Cet encombrement stérique autour du cuivre du chapeau TBTren entraîne une réduction du centre ferrique en premier pour fixer le dioxygène dans la cavité distale puis le cuivre se lie à son tour au dioxygène pour s’oxyder.

Le remplacement de la base proximale de 1-Fe par une base de type pyridinique ou par une base de type N-benzylimidazole plus rigide a montré en électrocatalyse une réduction à quatre

électrons avec une formation négligeable d’eau oxygénée.¹⁰⁷ Ces résultats montrent qu’un

léger changement structural de la base proximale de la porphyrine peut affecter également les propriétés catalytiques.

En 2002, le groupe de Collman décrit la synthèse d’une série de complexes 3, 4 et 5 (Figure 15), possédant trois imidazoles dans le site distal permettant la complexation du

cuivre et une base axiale proximale de type imidazole coordinant le fer.¹⁰⁸

Figure 14 : Modèle à chapeau TBTren avec une base axiale embarquée.104

Les deux sites de complexation sont reliés par des liaisons amides permettant de maintenir la distance fer-cuivre de ~5 Å. Le ligand utilisé possède des propriétés électroniques et structurales (ligands de type imidazole) qui modélisent plus fidèlement celles de la cavité distale du site actif de la CcO. Les résidus histidines complexant le cuivre possèdent des groupes NH qui pouvaient jouer un rôle important dans l’activité catalytique de l’enzyme. Ainsi, les groupements imidazole-NH contenus dans ces modèles sont susceptibles d’élucider la contribution de la liaison hydrogène dans le fonctionnement de la CcO.

Bien que les modèles 3, 4 et 5 soient des catalyseurs à quatre électrons pour la réduction de

l’oxygène moléculaire, leur réactivité vis-à-vis de l’oxygène est bien différente.¹⁰⁹ La

réactivité des complexes 3 et 5 avec le dioxygène induit la génération d’un intermédiaire

Fe^III/Cu^II µ-peroxo, tandisque celle du composé Fe/Cu[NMePr]⁺ (4) conduit à la formation

d’un superoxyde stable [Fea3^IIIO2.-/Cu^I] à température ambiante (Figure I.15).¹¹⁰ Malgré que

les centres redox hème/Cu réduits sont placés à une distance Fe-Cu et dans une sphère de coordination similaires à celles de l’enzyme, ils n’entraînent pas la formation d’un complexe

Fe[NMe] 3 Fe[NMePr] 4

Fe[NHPr] 5

oxygéné contenant un pont peroxyde entre l’hème et le cuivre, comme cela a été largement

observé pour les autres modèles de la CcO synthétisés auparavant. Le complexe 4-O2 présente

le premier modèle mimétique de l’intermédiaire oxy (A) de la CcO.

Étonnamment, les complexes Fe/Cu[NMePr]⁺ et Fe/[NMePr] présentent une affinité

différente pour le dioxygène. L’adduit FeO2/Cu[NMePr]⁺ peut être formé rapidement à

température ambiante, tandis que l’adduit FeO2/[NMePr] se dissocie et ne fixe complètement

l’oxygène qu’à basse température. De plus, le superoxyde Fe/Cu est beaucoup plus stable que celui du fer seul qui se dégrade rapidement. Ces études suggèrent que dans un régime de flux d’électrons rapide le Cu(I) assure la fixation de dioxygène sur le fer et le maintien de sa

stabilité en éliminant les peroxydes formés responsables de l’auto oxydation de l’adduit O2

-catalyseur.

Afin de mimer le groupement OH de la tyrosine 280 présent dans le site actif de la CcO, le groupe de Collman a étudié la réaction intermoléculaire entre l’adduit superoxyde

4-O2 et deux phénols stériquement encombrés (5 ou 6) (Figure 16).¹¹¹ Cette étude a révélé la

formation d’un radical phénoxyl à température ambiante, ce qui démontre le même type de réactivité que la CcO. Ces résultats ont également fourni une grande évidence sur la formation d’un intermédiaire de type hydroperoxo et d’un adduit oxoferryl, analogue de l’état P de la CcO, à partir de ce modèle.

Figure 16 : Réaction intermoléculaire entre l’adduit superoxo et deux phénols mimant la Tyr 280 de la CcO.¹¹¹

En 2004, l’équipe de Collman est parvenue à synthétiser un complexe binucléaire qui réunit les principales caractéristiques du site actif. Ce modèle 7 est marqué par l’introduction

4-O2

5 6

R = OMe

d’un phénol lié de manière covalente à un des imidazoles du site distal. Il constitue l’un des

premiers modèles reproduisant le plus fidèlement le site actif de la CcO (Figure 17).¹¹²

Par l’ajout de l’oxygène au complexe Fe^II/Cu^I du modèle 7 à -60°C, une espèce Fe^III

-superoxyde-CuI (7-Oxy) a pu être piégée et caractérisée. La spectroscopie de résonance

Raman a mis en évidence une bande à 575/549 cm-1 (16O2/18O2) sensible au marquage

isotopique de l’oxygène, et donc elle a été attribuée à la vibration d’élongation ν(Fe-O) des

espèces hème-superoxyde (Oxy).^111,113 Lors du réchauffement de la température à -40°C,

l’adduit 7-Oxy subit un processus redox intramoléculaire permettant la formation d’un intermédiaire oxoferryl mimant l’état P (Figure 17). Dans ce processus conduisant à l’espèce 7-Oxoferryl, le site Cu^I distal s’oxyde pour donner un complexe du Cu^II hydroxo ou aqueux ;

le Fe^III s’oxyde en un oxoferryl Fe^IV et le phénol se transforme en un radical phénoxyl. À

partir de l’intermédiaire 7-Oxy, l’apport d’un proton et d’un électron entraîne une rupture

hétérolytique de la liaison O-O, tel que cela a été observé pour la CcO.¹¹⁴

D’autres systèmes ont également pour ambition de reproduire la réduction tétraélectronique de l’oxygène de la CcO. Parmi ceux-ci nous citerons les porphyrines de fer

synthétisées comme modèles de la CcO par l’équipe de Boitrel^115,116 ; leur activité, en tant que

catalyseur de la réduction à 4e^- de l’oxygène a été étudiée à pH 7. Ces composés ont été

obtenus par greffage de motifs structuraux très différents sur la même porphyrine de fer, afin de modifier l’environnement de celle-ci par des tétraamines tripodales, des piquets, et des anses. Dans le cas des porphyrines portant un tripode, les amines secondaires du complexe ont été alkylées par différents substituants afin de modifier l’environnement électronique de la poche distale. Ces composés portent une base axiale exogène dans le site proximal de la porphyrine (Figure 18).

7-Oxoferryl 7-Oxy

7

Figure 17: Formation des intermédiaires oxy et oxoferryl à partir d’un modèle très semblable du site actif de l’enzyme.¹¹²

Figure 18 : Modèles tripodales(Boitrel et coll.).115

L’électrocatalyse de la réduction du dioxygène pour les complexes 8, 9 et 10 et leurs analogues du cuivre a été réalisée en milieu aqueux. Le potentiel de l’anneau de platine est fixé à 0,8 V par rapport à la référence AgCl/Ag, potentiel pour lequel les espèces partiellement réduites de l’oxygène éventiellement libérées lors de la réaction sur le disque sont réoxydées. De façon surprenante, les complexes obtenus en absence de cuivre présentent une activité biomimétique, puisqu’ils catalysent la réduction de l’oxygène moléculaire avec une très faible production de peroxyde d’hydrogène. Malgré les différences structurales de ces complexes, leur réactivité avec l’oxygène est la même. Ils permettent tous les trois la formation d’un intermédiaire oxygéné stable à température ambiante. Ces études montrent également que la coordination intramoléculaire d’une base azotée aux modèles 8, 9 et 10 n’est

pas nécessaire pour la réduction à 4e^- de l’oxygène.

Au vue de ces résultats, on peut penser que la présence du cuivre dans la réduction de l’oxygène ne semble pas être déterminante car à un pH proche des valeurs physiologiques, la porphyrine de fer, en elle-même, est un catalyseur efficace pour la réduction de l’oxygène en eau. Ces résultats soulèvent la question du rôle exact du cuivre qui semble loin d’être évident. Les études évoquées précédemment utilisent des porphyrines de fer adsorbées sur une électrode afin de modéliser le comportement catalytique de la CcO. Bien que ces modèles soient des catalyseurs intrinsèquement efficaces pour la réduction, ils ne permettent pas de

mettre en évidence les rôles du CuB et de la Tyr280. La réduction nécessite la fixation de

l’oxygène sur une porphyrine de fer et exige des électrons et des protons transférés rapidement au complexe oxygéné. Ces conditions sont à priori satisfaites lorsqu’une électrode modifiée par une porphyrine de fer se trouve en contact avec une solution aqueuse à pH 7. La

principale différence entre l’activité électrocatalytique des modèles synthétiques de la CcO adsorbés sur une électrode et celle de l’enzyme provient de la vitesse des électrons délivrés aux centres métalliques. Dans le cas des modèles, les électrons sont instantanément disponibles en grand excès à la surface de l’électrode, tandis que dans la CcO, les électrons sont transférés séquentiellement (un par un) du cytochrome c au centre binucléaire. De plus, la grande concentration des sites redox contenus dans les films des catalyseurs adsorbés sur l’électrode créé un environnement qui diffère notablement de celui de l’enzyme et dépend

significativement de l’état redox global du film.¹⁰⁹ Ainsi, le rôle du CuB dans le

fonctionnement de l’enzyme doit être élucidé et confirmé par différentes approches expérimentales.

Afin de contrôler le flux d’électron pendant l’électrocatalyse et de mimer la structure protéique autour de l’hème certains modèles notamment ceux développés par le groupe de Collman ont subi des changements structuraux ou ont été incorporés dans des matrices. De manière intéressante, l’étude de l’électrocatalyse des modèles synthétiques à hème/Cu (3 et 5, Figure 15) incorporés dans une matrice 1,2-dimyristoyl-L-α-phosphatidylcholine (PC) (Figure 19), un des constituants majoritaire de la membrane mitochondriale, a montré une réduction de l’oxygène sous des conditions plus biologiques : aux potentiels physiologiques, sous une diffusion limitée du flux d’électrons et sans libération des espèces oxygénées partiellement réduites dans le milieu. Les résultats obtenus montrent que, contrairement aux systèmes adsorbés sur l’électrode, les analogues hème/Cu et hème seul se diffèrent par leur comportement catalytique vis à vis l’oxygène. En effet, le complexe hème/Cu réduit de manière très efficace le dioxygène sans production des espèces partiellement réduites, tandis

que le complexe de fer seul se dégrade rapidement.¹¹⁷ Ainsi, ce système permet de mimer et

confirmer le rôle proposé pour le cuivre en tant que réservoir d’électrons au cours du cycle catalytique de l’enzyme.

Le groupe de Collman a développé une nouvelle méthode électrochimique en liant de manière covalente les catalyseurs à un film organique immobilisé sur la surface d’une

électrode d’or.¹¹⁸ Cette méthode consiste à préparer des « SAMs » (self-

assembled-mono-layers) par l’adsorption d’une longue chaîne d’alkyle de thiol sur le discque de l’électrode d’or. La vitesse de transfert d’électrons à travers le film SAM aux catalyseurs peut être contrôlée et mesurée. L’étape suivante nécessite un couplage covalent des modèles fonctionnels de l’oxydase à l’ensemble film- électrode (SAM). Afin de l’efficacité de cette réaction, particulièrement pour la fonctionnalisation de la surface d’électrode, l’équipe de Collman a choisi d’incorporer une fonction alcyne terminale sur la cinquième position de l’imidazole de la base axiale du catalyseur 11. L’alcyne est ensuite attachée de manière covalente à une fonction azide rattachée à un film « SAM » déposé sur une électrode d’or, par une réaction de cycloaddition catalysée par du cuivre(I) (Figure 20).

  Figure 20 : Modèle fonctionnel (11) de la CcO immobilisé sur une électrode d’or.¹¹⁹

Les résultats obtenus indiquent que lorsque le transfert d’électron est rapide (S2), l’analogue du fer seul réduit l’oxygène en eau avec une sélectivité de 89 ± 2% (d’électrons utilisés pour la formation de l’eau). De manière intéressante, les catalyseurs hème/Cu et

hème/Cu/phénol rattachés au film « SAM » (S2) montrent uniquement une légère

augmentation de la sélectivité d’électrons utilisés pour la formation de l’eau. Les auteurs proposent que l’absence d’une influence significative du groupement phénol électroactif résulte probablement de la capacité de l’électrode à délivrer un électron supplémentaire assez

rapidement à travers le film « SAM » (S2). Ce résultat démontre que la Tyr 280 n’est pas nécessaire lorsqu’un quatrième électron peut être rapidement délivré à l’intermédiaire oxygéné partiellement réduit. Cependant le transfert d’électron est lent (S1), le complexe hème/Cu/phénol catalyse la réduction de l’oxygène avec une très grande sélectivité (96%), tandis que le complexe de fer seul subit une dégradation.

Afin d’obtenir une détection plus efficace des espèces oxygénés partiellement réduits (PROS) formées lors de la réduction électrocatalytique de l’oxygène, ainsi que d’empêcher un éventuel dommage du film « SAM » dû aux grandes vitesses de rotation de l’électrode, l’équipe de Collman a étudié plusieurs porphyrines superstructurées immobilisées sur des

électrodes d’or-platine (IDAs) "interdigitated-array".¹²⁰ Ces électrodes IDAs permettent des

collections efficaces des espèces partiellement réduites de l’oxygène (PROS) de l’ordre de 65-90% par rapport à des valeurs inférieurs à 20% pour les électrodes RDE. Les complexes étudiés (Figure 21) sont également immobilisés par une réaction catalysée par le cuivre(I) entre l’azide terminal du «SAM» et la fonction alcyne des modèles.

Figure 21 : Effet des centres redox Cu(I) et phénol sur la formation de PROS.¹²⁰

L’emploi des conditions mimant la vitesse de transfert d’électrons du cytochrome c à la

CcO (2 s^-1) montre que le catalyseur contenant deux centres redox distaux (Cu(I) et un

groupement imidazole-phénol liés de manière covalente) génère uniquement 5 ± 1% de

PROS, ce qui indique une efficacité de 95% dans la réduction à 4e^- de l’oxygène. Cependant,

si un des centres redox est éliminé, la quantité de PROS augmente de 10 ± 1% en absence du groupement mimant la Tyr280 et de 20 ± 1% en absence du Cu(I). Dans le cas où le catalyseur n’est pas réduit, la quantité de PROS augmente significativement mais lorsque le

R = Me 12 R = o-C6H4OH 13

transfert d’électrons est rapide, cette quantité diminue à 10 ± 1%. Ces résultats corroborent bien avec ceux obtenus avec les électrodes RDE.

Les nouvelles approches développées par le groupe de Collman ont mis également en évidence un rôle crucial du cuivre et du phénol dans la réduction tétraélectronique de l’oxygène. Selon plusieurs auteurs, le cuivre joue un rôle essentiel dans l’activité catalytique de l’enzyme de façon à ce qu’un modèle ne peut être considéré biomimétique que s’il comprend une porphyrine de fer et un complexe de cuivre mais les études obtenues jusqu’à ce

jour ne permettent pas encore de détecter un rôle direct du Cu^I dans l’activation de la liaison

O-O.