Méthodes spectroscopiques

La formation des intermédiaires de la CcO est suivie par spectroscopie UV-visible. Les spectres d’absorption sont enregistrés dans des cuves en quartz de 1 cm de trajet optique avec un spectrophotomètre Cary 300 SCAN (Varian) à double faisceau. La mesure de la ligne de base s’effectue en comparant la cuve de référence à celle de mesure, ne contenant que du tampon.

La différence entre le spectre réduit et le spectre oxydé est mesurée. L’oxydase oxydée est

obtenue en ajoutant une très faible quantité de ferricyanure (K3Fe(CN)6) et la réduite par ajout

d’hydrosulfite (Na2S2O4). La concentration de la protéine est estimée en utilisant le coefficient

d’absorption molaire de la bande de Soret à 425 nm (εox425nm=158 mM^-1 cm^-1).

Les spectres de différence des intermédiaires PH, F^.H et FH (moins l’état O) sont

enregistrés après addition soit d’une quantité équimolaire, soit d’un excès de H2O2 (ε240nm= 40

M^-1 cm^-1).

L’intermédiaire PH est généré par l’ajout de 1 à 5 équivalents de H2O2 (Sigma Aldrich

30%) à une solution contenant 10 µM de la CcO oxydée dans un tampon KPi (Fluka ≥ 99,0 %) 50 mM, pH 9 et 0,05 % DDM. Le mélange est ensuite incubé pendant 3 minutes. La

diminution du pH à 6 de la solution précédente par l’ajout d’une solution de Mes-OH (Sigma

Aldrich) pH 6 à la concentration finale de 50 mM entraîne la formation de l’état F^.H. Après

une incubation d’environ 3 minutes, l’ajout d’un grand excès de H2O2 (1:500) à cette solution

permet la formation de l’intermédiaire FH. Ce dernier peut être également généré dans un

tampon KPi 50 mM, pH 9 et 0,05 % DDM. Sa formation est indépendante du pH.

Le spectre d’absorption de différence de l’intermédiaire P10 (moins l’état O) est enregistré

lorsque le pH de la solution de la CcO passe de 8 à 10. 10 µM de la CcO oxydée dans un tampon KPi 10 mM à pH 8 et 0,05 % DDM est mélangé avec une solution de glycine-OH

(Sigma Aldrich ≥ 99 %), pH 10 à la concentration finale 120 mM. La stabilité de l’état P10 est

suivie sur 30 minutes d’incubation. Une caractérisation spectrale est effectuée à différents intervalles de temps t (0, 1, 5, 10,…30 min).

1.2.2 Spectroscopie de fluorescence

Lors des expériences de fluorescence, les échantillons des différents intermédiaires sont préparés selon le protocole utilisé pour l’UV-Visible. Les spectres de fluorescence sont enregistrés au service commun d’analyses, de mesures physiques et de spectroscopie optique (Université de Strasbourg).

1.2.2.1 Mesures à l’état stationnaire

Les expériences de fluorescence ont été réalisées sur un spectrofluorimètre Jobin-Yvon Horiba Fluorolog FL3-22, équipé d’un porte-échantillon thermostaté, dans une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique.

Ce fluorimètre est un instrument à comptage de photons présentant une réponse linéaire

pour des intensités inférieures à 2 Mcps. La source d’excitation est une lampe à Xenon de

puissance 450 W et le détecteur est un TBX 04 (Horiba Jobin Yvon). La longueur d’onde d’excitation est sélectionnée par un monochromateur double réseau à deux fentes réglables. L’instabilité du faisceau d’excitation due aux fluctuations de la lampe est corrigée à l’aide d’une photodiode calibrée. Les fonctions de correction, à l’excitation comme à l’émission, et notamment la courbe de réponse du photomultiplicateur, sont définis par le constructeur et incorporées dans le logiciel de l’appareil (FluorEssence). Les spectres de fluorescence sont donc automatiquement corrigés. La largeur des fentes d’entrée et de sortie de chaque monochromateur est réglée afin d’obtenir le meilleur rapport signal/ bruit.

Après introduction du tampon KPi, 20 mM, pH 9 et 0.05 % DDM dans la cuvette, un aliquot de la protéine de la solution stock est ajouté pour obtenir une concentration finale de 3 µM environ. La concentration de la protéine ainsi que la formation de chaque intermédiaire sont vérifiées par l’enregistrement des spectres d’absorption entre 230 et 800 nm.

Dans ce travail, nous avons enregistré uniquement des spectres d’émission de fluorescence

pour chacun des intermédiaires de la CcO (O, PH, F^.H, FH et P10) formés. Ces mesures sont

effectuées à 5°C et en utilisant deux longueurs d’onde d’excitation différentes.

La longueur d’excitation pour le tryptophane est de 300 nm et les spectres d’émission de fluorescence sont enregistrés entre 310 et 500 nm. L’excitation à 300 nm permet d’étudier sélectivement la fluorescence des tryptophanes de la protéine.

La longueur d’onde d’excitation pour la tyrosine est de 275 nm et les spectres d’émission de fluorescence sont enregistrés entre 290 et 500 nm. Cependant, cette longueur d’onde permet d’étudier la fluorescence des résidus tyrosine et tryptophane.

Les bandes passantes sont de 3 nm en excitation et en émission. Le temps d’intégration est de 0.1s. Les spectres contrôles (tampons) seuls sont réalisés dans les mêmes conditions, et soustraits à ceux des échantillons nécessaires.

1.2.2.2 Mesures spectroscopiques résolues en temps

Les courbes de déclin de fluorescence sont obtenues en utilisant la technique impulsionelle selon la méthode du comptage de photon unique. Cette méthode consiste à exciter le fluorophore dans des conditions où l’on ne détecte qu’un seul photon de fluorescence (moins de 5 photons de fluorescence détectés par 100 impulsions d’excitation). L’intervalle de temps mesuré entre l’impulsion initiale et la détection du photon correspond au temps passé par une molécule à l’état excité.

La source d’excitation est constituée par une diode électroluminescente (NanoLED-295, Horib Jobin Yvon) émettant à 295 nm, ce qui permet d’étudier sélectivement la fluorescence des résidus tryptophane.

Les photons de fluorescence émis par l’échantillon sont détectés dans une direction perpendiculaire à l’excitation par un photomultiplicateur. Le gain du photomultiplicateur est tel qu’un seul photon génère une impulsion électrique d’anode mesurable (repère temporel).

canal correspondant est incrémenté d’une unité. Nous utilisons 2048 canaux pour l’analyse de l’amplitude, ce qui est combiné à l’échelle de temps de 50 ns. L’analyseur multicanaux est piloté par un ordinateur à l’aide d’une interface électronique gérée par le logiciel DataStation. Afin de reconstruire l’histogramme de la probabilité d’émission de fluorescence, il est nécessaire de répéter plusieurs fois la même mesure avec une grande vitesse de répétition. L’acquisition est généralement effectuée en régime de pré-comptage où le nombre total de photons à accumuler est fixé (typiquement 10000 événements).

Les paramètres optiques utilisés pour l’ensemble des mesures effectuées avec cet appareillage sont résumés ici :

 Longueur d’onde d’excitation à 295 nm,  Longueur d’onde d’émission à 330 nm,

 Taux de répétition des impulsions d’excitation : 1 MHz,

 Largeur temporelle par canal de 14.5 nm avec un nombre total de canaux de 2048,

Nombre total de coups par déclin : 1.10⁴,

 La mesure de l’étalon, une solution Ludox (une solution de silice colloidale, 40 % de suspension dans l’eau, provenant de Sigma-Aldrich) diluée à 0.01 %, prise comme référence, est effectuée avec le même de comptage que dans la mesure de l’échantillon,

 Fentes du photomultiplicateur d’émission : 14.5 nm.

L’analyse des déclins de fluorescence est effectuée par la méthode de statistique des moindres carrés en utilisant le logiciel DAS6 (Decay Analysis Software), provenant de Horiba Jovin Yvon.

Dans cette analyse, on suppose que la loi de fluorescence correspond à la relation suivante où correspond aux temps de vie de fluorescence.

exp exp exp … . exp

1.2.3 Spectroscopie ATR-FTIR en mode différentiel

Les spectres IRTF de différence sont enregistrés avec un spectromètre Bruker IFS 28 équipé d’une séparatrice KBr et d’un détecteur MCT (Mercure-Cadmium-Tellure) et couplé à une cellule ATR de perfusion (BioATR II unit) provenant de Bruker (Karlsruhe, Allemagne).

Cet accessoire ATR-perfusion à faible trajet optique (6-8 nm) est en réalité constitué de deux

cristaux joints (l’un en ZnSe et l’autre en silicium) et permet les mesures uniquement dans le

Le cristal de silicium, possédant une surface hydrophobe, est en contact direct avec l’échantillon. Cette cellule peut être connectée à un thermostat permettant de réaliser les expériences à basse température. Elle est composée d’un compartiment supérieur qui permet de fermer la cellule hermétiquement (Figure 38). L’ensemble est purgé de manière continue avec de l’air séché afin d’éviter les interférences qui peuvent être causées par la vapeur d’eau.

  Figure 38 : Schéma de la cellule à circulation ATR. Les flèches à l’intérieur de la cellule représentent le sens de circulation des différentes solutions tampons.

Dépôt du "culot"

Le culot de 1.5 µl est déposé sur le cristal de silicium et séchée pendant 1h. Elle est ensuite réhydratée avec 30 µl de tampon KPi 50 mM, pH 9. Puis, la cellule est fermée et la perfusion de la solution tampon est maintenue d’une manière continue à travers le cristal à l’aide d’une pompe assurant un débit de 0.2 ml/min.

Génération des intermédiaires

Dans un premier temps, un cycle d’oxydoréduction est effectué afin de maintenir la protéine dans son état activé en circulant d’abord une solution de tampon contenant de la dithionite (3mM) puis suivie par une autre solution contenant du ferricyanure (1mM). La

formation des intermédiaires PH et FH s’effectue en circulant une solution de tampon

Figure 39 : une photo du montage expérimental utilisé lors des expériences de formation et suivi des intermédiaires de la CcO. Le circuit fermé se compose (de gauche à droite) : d’un flacon contenant la solution du tampon, d’une pompe assurant un débit constant égal à 0.2 ml/min et de la cellule à circulation disposée à l’intérieur du spectromètre Bruker. Les différents éléments sont reliés par des tuyaux en silicone.

Acquisition des spectres différentiels

Les spectres ATR-IRTF de différence sont obtenus avec le même échantillon de CcO et résultent de la moyenne de 3 cycles redox indépendants. Ils sont enregistrés avec 128 scans, à

une résolution spectrale de 4 cm^-1 et à 7°C.

Le spectromètre est relié à un système informatique permettant le pilotage, l’enregistrement et l’accumulation des données par le logiciel OPUS (OPtics Users Software, Brucker). Il permet de corriger la ligne de base des spectres et d’éliminer la contribution de la vapeur d’eau au signal.

1.2.4 Spectroscopie IRTF en mode ATR ou transmission

Les spectres de l’infrarouge lointain des intermédiaires de la CcO sont enregistrés sur un spectromètre Bruker Vertex 70, équipé d’une séparatrice Silicium et d’un détecteur DTGS (Deuterated Tri-Glycine Sulfate).

Mode ATR

Les spectres ATR-IRTF sont obtenus à l’aide d’une unité ATR (Harrick unit) couplée au spectromètre. L’échantillon de 2 µl est déposé sur le cristal (Diamant) de l’ATR, puis il est

Solution de tampon dans la glace 

séché avec un faible flux d’argon. Les spectres sont enregistrés dans les conditions suivantes :

128 scans, à une résolution spectrale de 4 cm^-1 et à température ambiante.

Mode transmission

L’échantillon de 4 µl est déposé sur une fenêtre de silicium ou de polyéthylène entourée de 6 joints très fins et placée dans un support en métal. Le support est ensuite placé à l’intérieur du spectromètre et relié au thermostat. Les spectres sont enregistrés dans les conditions

suivantes : 64 scans, à une résolution spectrale de 4 cm^-1 et à 6°C.