Mise au point de la technique de la RT-PCR sur DUM neurone

J.2.1 Prélèvement des cytoplasmes

Les neurones DUM sont prélevés au niveau du dernier ganglion abdominal de la chaine nerveuse de P. americana puis isolés par la technique de dissociation cellulaire (Lapied et coll., 1989) (Matériels et Méthodes/Chapitre 3/A1). Après une incubation de 24 heures dans une étuve à 29°C, les neurones DUM sont sélectionnés visuellement selon des critères morphologiques à savoir une forme pyriforme et une taille voisine de 50 µM (Figure 23). Le cytoplasme est prélevé avec une pipette de patch contenant 8 µl de solution intrapipette et possédant une résistance comprise entre 0.7 et 0.9 MOhm. Après l’établissement de la configuration dite « cellule entière », l’activité électrique spontanée des neurones DUM est contrôlée par des mesures en courant imposé (B.4 Partie 2). La mesure de cette activité spontanée est importante puisqu’elle témoigne de l’expression des canaux Na_v. Puis, le cytoplasme est aspiré dans la pipette de patch en appliquant une pression négative. Il est important de contrôler visuellement l’aspiration du cytoplasme dans la pipette pour ajuster la pression négative. Quand une faible portion de la cellule reste en dehors de la pipette alors cette dernière est retirée délicatement du bain tout en maintenant la pression négative à l’interface liquide-air. Puis le cytoplasme est aussitôt éjecté dans un tube Eppendorf® Biopur refroidi contenant 1 µl de tampon (Tris 200 mM pH 8,5) et 1 µl de l’inhibiteur de ribonucléase RNasin® Plus (Promega).

J.2.2 RT-PCR multiplex emboîtée

(a) Conception des amorces spécifiques pour amplifier les transcrits exprimés dans les neurones DUM

Pour caractériser les variants codant la sous-unité α du canal sodium exprimés dans les neurones DUM nous avons choisi d’amplifier de manière séquentielle des régions intéressantes comportant des exons alternatifs. Pour amplifier chaque région d’intérêt, trois à quatre oligonucléotides spécifiques ont été conçus de manière à générer des amplicons d’une taille comprise entre 200 et 800 pb. Cette contrainte est imposée par la limite de

détection de la technique de la RT-PCR sur cellule unique capable d’amplifier des transcrits de taille modeste (Tableau 19 et Figure 37). Le transcrit codant l’actine (numéro d’accession GenBank AY33345), protéine composante du cytosquelette et fortement exprimée, a été amplifié pour évaluer la quantité d’ADNc et détecter des contaminations d’ADNg (K. 3.2) (Tableau 19 et Figure 37).

Tableau 19 : Oligonucléotides spécifiques conçus pour amplifier les transcrits à partir de la RT-PCR sur neurone DUM isolé. La température de fusion Tm est déterminée à partir de la formule 4AT+2GC. Transcrit d'intérêt Nom de l'oligonucléotide ^{Séquence Tm (°C)} L1-1S 5'-CATTGTCGCCATGTCATACGACG-3' 66 L1-2S 5'-TATTCTTGGAACTTGAGCCACAGC-3' 70 L1-3AS 5'-GAAGAATAGTTGGAGCCAACGG-3' 66 L2-1S 5'-CTTTGGTTCCTCGAATCTGTCG-3' 66 L2-2AS 5'-CTTGTTCTCGATGAGCTGGAAG-3' 66 L2-3AS 5'-TTTTCAGGACAGCAATCCGCAG-3' 66 DIII-1S 5'-CCTCGGCTTCAAGAAGTACTTCA-3' 70 DIII-2AS 5'-CGTTCATGATCTGAATCCATCCC-3' 70 DIII-3AS 5'-CACGTGTAGTTCTCAGCAATGC-3' 66 IVS3-S 5'-GATTTCGTAGTTGTCATCCTCTC-3' 66 IVS6-AS 5'-GACGAGATATGACAGAAGGAAGGC-3' 72 IVploop-AS 5'-CCAATAGTCGCAGATCCACAG-3' 64 PaF-IS3-S 5'-GGTTACATAACGCTCGTGGTTG-3' 66 PaF-Ipl-1AS 5'-AAGGCCCAACCGAATGTATCG-3' 66 PaF-Ipl-2AS 5'-GTCATCAGGAATGTACCAATGCG-3' 68 Act-1S 5'-CTGACCCTTAAATACCCCATTG-3' 60 Act-2AS 5'-CACAATTTCTCGTTCGGCGTG-3' 60 Act-3S 5'-CACGGTATCGTGACCAACTG-3' 62 Act-4AS 5'-GTAAAGCTGTAACCACGCTCAG-3' 66 Sous-unité PaFPC (Domaine I) Sous-unité PaNav1 (DIV) Actine Sous unité PaNav1 (boucle 1) Sous unité PaNav1 (boucle 2) Sous unité PaNav1 (Domaine III)

Figure 37 : Schéma montrant la disposition des amorces spécifiques utilisées pour amplifier plusieurs transcrits exprimés dans les neurones DUM.

(b) Transcription inverse des ARN totaux de neurone DUM isolé

La transcription inverse est réalisée sans purification préalable des ARN totaux afin de limiter au maximum toute perte de matériel. Par ailleurs, pour éviter des contaminations à l’ADNg, un traitement à la désoxyribonucléase I est réalisé préalablement à la transcription inverse. La désoxyribonucléase I est activée 15 minutes à 37°C puis inactivée à 70°C pendant 5 minutes.

Dans le tube contenant le cytoplasme traité à la désoxyribonucléase I, nous ajoutons directement 7,5 µl d’un premier assemblage contenant 1 µl d’une solution contenant 5 mM de chaque dNTP, 25 ng/µl d’hexanucléotides aléatoires et 6,5 µl de Tris 10 mM pH 8,5. Les hexanucléotides aléatoires servent d’amorce à la transcription inverse et présentent l’intérêt de pouvoir rétro-transcrire des transcrits tronqués. L’hybridation des hexanucléotides aléatoires à l’ARN est réalisée en chauffant cet assemblage pendant 5 minutes à 65°C au bain marie, suivie immédiatement d’une incubation de 1 minute dans la glace. Ensuite 10 mM final de DTT, 5 mM final de MgCl2 et 1 µL de transcriptase inverse associée à un inhibiteur d’ARNase (SuperScript III^TM Reverse Transcriptase Rnase/ RNase Out, kit Super III First strand, Invitrogen^TM) sont ajoutés au premier assemblage. Cette transcriptase inverse a été choisie car elle permet de rétro-transcrire entre 0,1 pg et 5 µg d’ARN totaux. La concentration finale de DTT et de MgCl₂ a été ajustée de manière à optimiser l’activité de la transcriptase inverse tout en préservant l’activité des ADN polymérases thermostables. Après une incubation de 10 minutes à 25°C, la trans cription inverse est réalisée pendant 50 minutes à 50°C. Les enzymes sont ensuite inactivées par chauffage (5 minutes, 85°C). Afin d’éliminer les fragments d’ARN des fragments hybrides ARN-ADN on ajoute 0,3 U de ribonucléase H (Promega, France) dont l’activité est maintenue pendant 20 minutes à 37°C. Les ADNc obtenus sont conservés à –20°C jusqu’à leu r utilisation.

(c) RT-PCR multiplex emboîtée

La PCR multiplexe emboitée se réalise en deux étapes successives d’amplification par PCR. La première PCR consiste en une préamplification de n transcrits dans 1 seul tube avec n couples d’amorces spécifiques. La seconde PCR permet d’amplifier

1) Première PCR : PCR multiplexe

La première PCR est réalisée dans un volume final de 100 µL avec comme matrice la totalité de l’ADNc de neurone DUM isolé, soit 10 µl. Les transcrits sont amplifiés simultanément par l’ADN polymérase thermostable KOD HiFi dans un milieu réactionnel standard (E.3) excepté que chaque amorce est ajustée à une concentration finale de 0,6 µM. Le programme de température est le suivant: [95°C 3 min, 35 fois * (95°C 30sec, 60°C 30sec, 72°C 90s), 72°C 2min]. Les produits de cette premiè re PCR sont purifiés à l’aide du kit NucleoSpin^® Extract II (Macherey-Nagel) afin d’éliminer les sels, l’enzyme et les oligonucléotides. Ces produits de PCR purifiés constituent la matrice des PCR suivantes.

2) Seconde PCR : PCR emboitée

La seconde PCR permet d’amplifier séparément chaque transcrit à partir d’amorces internes spécifiques. Cette PCR est réalisée dans un volume final de 20 µl à partir de l’ADN polymérase thermostable EuroTaq. Le milieu réactionnel de la PCR est standard. Le programme de cette seconde PCR est le suivant: [94°C 2min; 35 * (94°C 30sec, 60°C 30sec, 72°C: 1min/kb), 72°C: 5min].

Les produits de la seconde PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Pour caractériser la séquence nucléique des transcrits codant le canal Nav, les produits de PCR sont purifiés puis clonés dans le vecteur pCR^®-4-TOPO^® et multipliés dans bactéries chimiocompétentes DH5α™-T1^R de la même façon que décrite précédemment (I).