Amplification d’une région conservée à partir d’oligonucléotides

dégénérés

G.1.1 Conception des oligonucléotides dégénérés pour amplifier la sous-unité auxiliaire PaTEH1

maximum de résidus d’acides aminés au code génétique peu dégénéré (M, W, F, Y, S, C, H, Q, N, K, D, E). Ensuite, nous avons diminué la dégénérescence des oligonucléotides en déterminant les acides nucléiques à partir de l’alignement multiple des séquences nucléiques codant les résidus d’acide aminés sélectionnés (Figure 31).

Figure 31 : Alignements protéiques et nucléiques de séquences codant les domaines

transmembranaires TM1 et TM2 des sous-unités auxiliaires orthologues à DmTEH1 chez cinq espèces d’insectes.

Seules les régions sélectionnées pour concevoir des oligonucléotides dégénérés sont exposées. Les nucléobases conservées entres les 5 espèces sont mentionnées en noir. Les bases nucléiques divergentes sont indiquées en vert et rouge. Seules les bases nucléiques en rouge ont été dégénérées pour concevoir les oligonucléotides TEH1.1S et TEH1.2AS. Les bases dégénérées sont d’après le code IUB suivant : S (G, C) ; Y (T, C) et M (A, C). Anopheles gambiae (XM_310354), Apis mellifera (XM_001120804), Drosophila melanogaster (DQ139957), Nasonia vitripennis (XM_001606785), Tribolium castaneum (XM_964728).

G.1.2 Conditions de PCR pour amplifier la sous-unité PaTEH1 à partir d’oligonucléotides dégénérés

Les conditions de PCR ayant permis d’amplifier des ADNc codant la sous-unité PaTEH1 ont été réalisée à partir du protocole standard en employant l’ADN polymérase thermostable EuroTaq. Le programme de température est le suivant: 94°C 2 min, 35* [94°C 20s, 60°C 30s, 72°C 30s], 72°C 5 min.

G.2 Amplification des régions 5’ et 3’ non codantes

De la même façon que pour la sous-unité α, nous avons conçus des oligonucléotides spécifiques ciblant la sous-unité PaTEH1 à partir des informations de séquence obtenues lors du sous clonage des produits de PCR décrits ci-dessus (G.1). Les oligonucléotides ont été conçus de manière à ce que les produits des PCR1 et PCR2 différent d’une centaine de paire de base pour être comparables après électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 30). Des oligonucléotides supplémentaires ont été conçus de manière à pourvoir réaliser des PCRs internes à partir des produits de PCRs emboitées pour s’assurer de la spécificité des amplicons (Figure 30). Les régions 5‘ et 3’ non codantes de la sous-unité PaTEH1 ont été amplifiées à partir d’ARN purifiés de la chaine nerveuse par les mêmes méthodes de RACE-PCR décrites précédemment (E.2.1.a).

G.2.1 Amplification de la région 5’UTR par RLM-RACE-PCR

La région 5’UTR de la sous-unité PaTEH1 a été amplifiée en utilisant le kit GeneRacer™ (Invitrogen™) selon les instructions du fabricant (Figure 28) et les oligonucléotides spécifiques ciblant le domaine transmembranaire TM1 (Tableau 16). La première PCR est réalisée dans un milieu réactionnel de 50 µl à partir de 1 µl d’ADNc en utilisant l’ADN polymérase EuroTaq dans les conditions standards. L’amorce GR1™ est utilisée à une concentration finale de 0,9 µM alors que l’amorce TEH1-8AS est ajoutée à une concentration finale de 0,3 µM. Le programme de PCR est le suivant : 94°C 4 min, 35*[94°C 20s, 62°C 30s, 72°C 90s], 72°C 5 min. La seconde PC R emboitée a été effectuée avec comme matrice 1 µl de la PCR 1 en appliquant le même protocole excepté que les amorces GR2™ et TEH1-7AS sont utilisées à une concentration finale de 0,3 µM chacune. Une PCR interne avec comme matrice la PCR2 permet de contrôler la spécificité des amplicons de la PCR2 avant leur sous clonage.

Tableau 16: Oligonucléotides spécifiques ciblant l’adaptateur du kit GeneRacer™ (GR1™ et GR2™) et le domaine transmembranaire TM1 de la sous-unité auxiliaire PaTEH1 du canal sodium de la blatte P. americana.

Région ^Région

d’intérêt

Nom des amorces

Séquence nucléique des oligonucléotides

Tm (°C)

GR1™ 5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′ 74

GR2™ 5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′ 78

TEH1 -7AS 5’-CGATGGGGATGTTGATGTTGAC-3’ 66 TEH1-8AS 5’-CGTACATGGTGGTGAAGTTGTC-3’ 66 TEH1-10S 5'-GCCAGTGAAATGTGTGACCACTC-3' 66 Adaptateur GeneRacer™ Sous-unité PaTEH1 5’ non codant

Tm correspond à la température de fusion des oligonucléotides déterminée selon la formule Tm=4GC+2AT. L’oligonucléotide TEH1-7AS a été utilisé en PCR1, l’oligonucléotide TEH1-8AS a été utilisé en PCR2 et les oligonucléotides TEH1-10S et TEH1-7AS ont permis de réaliser une PCR interne de contrôle avec comme matrice la PCR2.

G.2.2 Amplification de la région 3’ UTR par RACE-PCR

La région 3’ UTR de la sous-unité PaTEH1 a été amplifiée par une technique classique de RACE-PCR (Figure 30). Les oligonucléotides utilisés pour amplifier les régions 3’ UTR sont référencés dans le Tableau 17. La première PCR a été réalisée à partir d’un milieu réactionnel standard d’amplification des régions 3’ non codante avec l’ADN polymérase thermostable EuroTaq. Le programme de la PCR a été conçu de manière à favoriser l’hybridation de l’oligonucléotide Adapt (dT)₂₂ à faible température dans un premier temps tout en favorisant l’hybridation spécifique de l’amorce TEH1-7S à plus haute température dans un second temps. Pour cela 3 cycles de PCR avec des températures d’hybridation croissantes ont été programmés successivement de la façon suivante : 94°C 4 min, 5*[94°c 20s, 50°C 30s, 72°C 90s], 5*[94°c 20s, 55°C 30s, 72°C 90s], 20*[94°c 20s, 50°C 30s, 72°C 60s], 72°C 5 min. La seconde PCR a é té effectuée avec comme matrice 1 µl de produit de la PCR1 et un protocole standard d’utilisation de l’ADN polymérase EuroTaq. Les conditions d’amplification ont été les suivantes : 94°C 4 min, 35*[94°c 20s, 60°C 30s, 72°C 90s], 72°C 5 min. Une PCR interne avec comme m atrice la PCR2 permet de contrôler la spécificité des amplicons de la PCR2 avant leur sous clonage.

Tableau 17 : Oligonucléotides spécifiques ciblant la queue polyA des ADNc double brin et le domaine transmembranaire TM1 de la sous-unité auxiliaire PaTEH1 du canal sodium de la blatte P. americana.

Région NC ^Région d’intérêt

Nom des amorces

Séquence nucléique des oligonucléotides Tm (°C) Adapt (dT)₂₂ 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)22-3’ Adapt 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’ 66 TEH1-7S 5’-GTCAACATCAACATCCCCATCG-3’ 66 TEH1-8S 5’-GACAACTTCACCACCATGTACG-3’ 66 TEH1-5AS 5-CGAAGTAATGGATGATGATGGCG-3' 66 Adaptateur de la queue polyA 3’ non codant _Sous-unité PaTEH1

Tm correspond à la température de fusion des oligonucléotides déterminée selon la formule Tm=4GC+2AT. L’oligonucléotide TEH1-7S a été utilisé en PCR1, l’oligonucléotide TEH1-8S a été utilisé en PCR2 et les oligonucléotides TEH1-8S et TEH1-5AS ont permis de réaliser une PCR interne de contrôle avec comme matrice la PCR2.