Mesures électrophysiologiques des courants Na + par patch-clamp

A.2.1 Présentation de la technique du patch-clamp en configuration cellule-entière

Pour enregistrer les courants Na⁺ des neurones DUM, nous avons eu recours à la technique du patch-clamp. Cette technique mise au point par Neher et Sakmann à la fin des années 70 fût améliorée par Hamill et collaborateurs en 1981. Le principe consiste à étudier les courants ioniques d’un ou plusieurs canaux ioniques, en isolant électriquement une portion de membrane. Pour ce faire, une pipette de patch est approchée délicatement à proximité de la membrane du neurone. Lorsque l’extrémité de la pipette atteint la membrane de la cellule, une pression négative est exercée pour créer une zone de forte résistance électrique entre la pointe de la pipette et la membrane de la cellule. Cette résistance, appelée résistance de scellement ou « seal », peut atteindre plusieurs gigaohms (10⁹Ω). Ainsi, la région de la membrane située sous la pointe de la pipette est isolée électriquement du reste de la cellule, c’est la configuration dite « cellule attachée » (Figure 38). Une aspiration supplémentaire à travers la pipette de patch-clamp est appliquée jusqu’à provoquer la rupture de la membrane afin d’obtenir la configuration dite « cellule entière » (Figure 38). A ce moment, une continuité physique et électrique est établie entre la pipette et le cytoplasme de la cellule. De plus, la composition du milieu intracellulaire est contrôlée via la composition de la solution contenue dans la pipette de patch.

A partir de la configuration « cellule entière », des variations du potentiel de la membrane ou des courants ioniques macroscopiques résultant de l’activité électrique de l’ensemble des canaux ioniques présents à la surface de la membrane peuvent être enregistrés respectivement dans des conditions de courant imposé ou de potentiel imposé, de telles sorte que :

I = N xPo_(t,V) x i (1)

Où I est le courant macroscopique ; N, le nombre de canaux ; Po, la probabilité d’ouverture d’un canal ionique à un instant t et à un potentiel V et i, le courant élémentaire qui traverse un seul canal ionique.

L’inconvénient majeur de cette configuration est la dilution des composants du milieu intracellulaire indispensable au bon fonctionnement des canaux ioniques (processus de « wash-out ») qui entraîne une réduction progressive de l’amplitude du courant au cours du temps (phénomène de « run-down »). Ainsi, pour contrer ce phénomène la solution du milieu intrapipette est enrichie en éléments énergétiques (e.g. ATP, GTP).

Figure 38 : Configurations d’enregistrement de la technique du patch-clamp.

Un ensemble de canaux ioniques et de récepteurs membranaires sont schématisés à la surface de la membrane.

A.2.2 Dispositif expérimental

Les boîtes de Pétri contenant les corps cellulaires des neurones DUM isolés sont placées sur la platine d’un microscope inversé (Olympus CK2, Olympus, Rungis, France) déposé sur une table antivibratoire au centre d’une cage de Faraday. La pipette de patch est maintenue sur un porte-pipette fixé à la tête de l’amplificateur opérationnel (AOP). Cet ensemble pipette et tête de l’amplificateur est déplacé manuellement au dessus de la cellule. Un micromanipulateur piézo-électrique tridimentionnel (Burleigh TS-5000-150, Burleigh Instruments, New York, USA) permet d’ajuster finement la disposition de la pipette par rapport à la cellule.

courants Na⁺). Lorsque la pipette est plongée dans la solution extracellulaire, un potentiel dit de jonction se crée en raison des différences de compositions ioniques entre les solutions. Ce potentiel est toujours annulé avant la formation du scellement.

La pipette est connectée via la tête de l’amplificateur à une des bornes de l’AOP (Axopatch 200A, Axon Instrument, Foster City, CA). Ce dernier est relié à :

1) un oscilloscope numérique (Nicolet 310, Nicolet instruments, Madison, USA) pour visualiser les signaux physiologiques,

2) un stimulateur programmable (SMP-310, Biologic, Claix, France) pour appliquer des stimulations électrique à la préparation

3) un ordinateur PC pour enregistrer les signaux via une interface (Digidata 1322 interface, Axon instruments, Foster City, US).

Les courants ioniques et les potentiels d’action sont enregistrés et mesurés à l’aide du logiciel pClamp10 (10.0.0., Axon Instruments, Foster City, USA). L’analyse des courants ioniques enregistrés est effectuée par l’intermédiaire du logiciel Clampfit (version 8.0.2, Axon instrument) et les données numériques sont analysées par le logiciel Prism (version 4.0, GraphPad, USA).

A.2.3 Composition et application des solutions

La composition des solutions extracellulaires et intrapipettes est déterminée de manière à pouvoir enregistrer soit l’activité électrique spontanée, soit les courants Na⁺ (Tableau 21 ) (Lapied et coll., 1989, Lapied et coll., 1990, Lavialle-Defaix et coll., 2006). Pour isoler les courants Na⁺, les solutions comprennent notamment des ions non perméants aux canaux calciques (cadmium et césium) et des agents pharmacologiques inhibiteurs des canaux potassiques (Ex : 4-AP).

Tableau 21 : Composition des solutions extracellulaires et intrapipette utilisées lors des expériences de pacth-clamp dans les conditions de courant imposé et de potentiel imposé. * pH ajusté avec NaOH 1M, ** pH ajusté avec KOH 1M, *** pH ajusté avec CsOH 1M

NaCl 200 K-aspartate 160 KCl 3,1 K-fluorure 10 MgCl2 4 NaCl 10 CaCl2 5 MgCl2 1 HEPES 10 CaCl2 0,5 pH 7,4* EGTA 10 HEPES 10 ATP-Mg 1 pH 7,4** NaCl 80 CsCl 90 TEA-Cl 100 CsF 70 KCl 3,1 NaCl 15 CaCl2 2 MgCl2 1 MgCl2 7 EGTA 5 CdCl2 1 HEPES 10 4-AP 5 ATP-Mg 3 HEPES 10 pH 7,4*** pH 7,4* Composition solution extracellulaire (mM) Composition solution intrapipette (mM) Courant imposé Potentiel imposé

Les solutions extracellulaires sont appliquées par perfusions gravimétriques multicanaux.

A.2.4 Protocoles de stimulation et analyse des données

Lors de l’établissement de la configuration entière, le potentiel imposé à la cellule est ajusté de telle sorte que les canaux Na⁺ des neurones DUM soient tous fermés at activables, soit un potentiel de maintien de -90 mV (Lapied et coll., 1989, Lapied et coll., 1990, Lavialle-Defaix et coll., 2006).

obtenue (Imax). La courbe I/V des courants Na⁺ des neurones DUM est alors ajustée selon l’équation de Stühmer (Lapied et coll., 1990) :

INa=G * (1-(1/1+exp((V-V_0,5)/K)))) * (V-V_rev)

Où G est la conductance, V le potentiel testé, V_0,5 le potentiel pour lequel la moitié des canaux sont ouverts, K la constante d’activation et V_rev le potentiel d’inversion.

(b) Mesure de l’activation à l’état stable

L’activation à l’état stable est déterminée selon un protocole analogue à celui employé pour déterminer la courbe I/V. Dans un permier temps, nous avons déterminé la conductance (G) des canaux Na_v pour chaque potentiel testé à partir de la formule :

G=I/(V-Vr)

Où I est l’intensité du courant relevé pour un pontentiel donné V, et Vr est le potentiel d’inversion, c'est-à-dire le potentiel pour lequel la courbe I/V coupe l’axe des abscisses.

Puis les conductances sont normalisées (G/Gmax) et la courbe d’activation est analysée à partir de l’équation de Boltzmann :

m∞ = 1/(1+exp[(V_0,5-V)/K])

où V est le potentiel testé, V_0,5 le potentiel pour lequel 50% des canaux sont activés et K le facteur de pente.

(c) Mesure de l’inactivation à l’état stable

L’inactivation à l’état stable est déterminée à partir d’un protocole à double choc. Le principe consiste à appliquer un premier choc d’une durée de 500 ms entre -100 mV et +40 mV par décrément de 10 mV. Après ce premier choc, le potentiel de la membrane est rétabli à -90 mV pendant 1 ms, puis un second choc jusqu’à 0 mV est appliqué pendant une durée de 30 ms. Plus le potentiel du premier choc est dépolarisant, plus le nombre de canaux Na_v à l’état inactivé augmente, et plus le courant Na⁺ mesuré lors du second choc diminue.

A partir des familles de courants enregistrées lors du second choc, les courants sont normalisés par rapport à Imax. La courbe de l’inactivation à l’état stable est analysée à partir de l’équation de Boltzmann :

I/Imax = 1/(1+exp((V-V0,5)/k))

où I est le courant sodium, Imax le courant au pic obtenu à –100mV, V_0,5 est le potentiel pour lequel la moitié des canaux sodium sont inactivés et K correspond au facteur de pente.