Amplification des régions 5’et 3’ non codantes

A partir des informations de séquences obtenues à l’issue de la PCR1 et de la PCR6, des oligonucléotides spécifiques antisens et sens ciblant la sous-unité α du canal sodium de P. americana ont été conçus pour amplifier les régions 5’ et 3’ non codantes respectivement. Etant donné que nous ne connaissons pas la séquence nucléique des extrémités des régions 5’ et 3’ non codantes, des séquences adaptatrices connues sont liguées aux acides nucléiques en 5’ et en 3’ pour permettre leur amplification. Pour ce faire, deux variantes de la technique de RACE-PCR ont été appliquées pour amplifier ces régions. Pour la région 5’ non codante il s’agit de la technique RLM-RACE-PCR et pour la région 3’ non codante il s’agit de la technique RACE-PCR classique. Ces régions ont été amplifiées à partir d’ADNc obtenus après transcription inverse des ARN messagers purifiés de la chaine nerveuse. Le succès de l’amplification des régions 5’ et 3’ non codantes dépend beaucoup

E.2.1 Amplification de la région 5’UTR par la méthode de la RLM-RACE PCR

(a) Présentation générale de la méthode RLM-RACE PCR

La technique de la RLM-RACE-PCR développée dans le kit GeneRacer™ (Invitrogen™) que nous avons utilisé est une variante de la RACE-PCR (Figure 28). L’intérêt de cette méthode est de favoriser le clonage d’ARNm pourvus d’une coiffe en 5’ grâce à la ligation d’une séquence d’ARN adaptatrice avant la transcription inverse. Brièvement, le principe consiste à liguer avec une T4 ARN ligase une séquence d’ARN adaptatrice uniquement aux ARNm intacts. Pour cela les ARNs messagers dégradés sont déphosphorylés par la phosphatase CIP (Figure 28, étape 1) et la coiffe des ARNm est hydrolysée par la pyrophosphatase TAP (Figure 28, étape 2). La transcription inverse est réalisée de la même façon que celle décrite dans la partie D de ce chapitre. Les ADNc ainsi produits contiennent alors la séquence de l’adaptateur en 5’ (Figure 28, étape 5a). Des oligonucléotides spécifiques de cette séquence adaptatrice et du transcrit d’intérêt sont alors utilisés pour amplifier la région 5’ non codante à l’issue de PCRs emboitées.

(b) Conditions d’amplification de la région 5’non codante de la sous-unité α

Après avoir purifié les ARN totaux et préparé les ADNc selon les instructions du kit GeneRacer™ (Invitrogen™) nous avons réalisé deux PCRs pour amplifier la région 5’ non codante de la sous-unité α. La première PCR est réalisée dans un volume final de 50 µl à partir de 1 µl d’ADNc en utilisant l’ADN polymérase thermostable KOD HIFI (Tableau 12) selon le protocole standard. L’amorce GR1™ est ajoutée à une concentration finale de 0.9 µM tandis que l’amorce spécifique P1D1-AS1 est maintenue à une concentration finale de 0,3 µM. Le programme de PCR est le suivant : 94°C 4 min, 35*[94°c 20s, 64°C 30s, 72°C 2 min], 72°C 8 min. La seconde PCR est réalisée ave c 1 µl de la première PCR et l’ADN polymérase thermostable EuroTaq (Tableau 12) dans un volume final de 100 µl selon les instructions standards. Le programme de température est le suivant : 94°C 4 min, 35*[94°c 20s, 65°c 30s, 72°C 90 s], 72°C 8 min.

Tableau 12: Oligonucléotides spécifiques ciblant l’adaptateur du kit GeneRacer™ (GR1 et GR2) et le domaine I de la sous-unité principale α du canal sodium de la blatte P. americana.

Région Transcrit d’intérêt

Nom des amorces

Séquence nucléique des oligonucléotides Tm (°C) GR1™ 5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′ 74 GR2™ 5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′ 78 P1DI-AS1 5’-GCAAACACGGAGAGTGAGAACATG-3’ 72 P1DI-AS2 5’-CTTAACGGCCGACTCAAATGTG-3’ 66 5’ non codant Adaptateur GeneRacer™ Sous-unité α

Tm correspond à la température de fusion des amorces déterminée selon la formule 4GC+2AT.

E.2.2 Amplification de la région 3’ non codante par la méthode de RACE-PCR

(a) Présentation générale de la méthode RACE-PCR pour amplifier les régions 3’non codante

La région 3’ non codante de la sous-unité α a été amplifiée par une technique classique de RACE-PCR. A partir des ADNc obtenus par transcription inverse comme décrit précédemment (Matériels et Méthodes/chapitre 2/ Parties B et C) deux PCR emboitées ont été effectuées (Figure 28 Etape 5b). Les oligonucléotides utilisés pour amplifier les régions 3’ non codantes sont référencés dans le Tableau 13. Au cours de la première PCR, le polyT de l’oligonucléotide Adapt (dT)₂₀ cible la queue poly A des ADNc double brin. Puis au cours de

la seconde PCR, l’oligonucléotide Adapt s’hybride de manière complémentaire à la séquence adaptatrice de l’oligonucléotide Adapt (dT)₂₀.

(b) Conditions d’amplification de la région 3’ non codante de la sous-unité α

La première PCR a consisté à préamplifier la région 3’ non codante en utilisant l’oligonucléotide dégénéré M1505S et l’oligonucléotide Adapt(dT)₂₀. La PCR a été réalisée en utilisant l’ADN polymérase Platimum® (Tableau 13) à partir de 1 µl de matrice dans un volume finale de 20 µl préparé selon les conditions standards. L’oligonucléotide M1505S est utilisé à une concentration finale de 20 µM tandis que l’oligonucléotide Adapt (dT)₂₀ est ajusté à une concentration finale de 0,3 µM. Le programme de température est le suivant: 94°C 5 min, 35*[94°C 30s, 50 °C 30s, 72°C 2 min], 7 2°C 4 min. La seconde PCR a été réalisée à partir de 1 µl de la première PCR dans les conditions décrites ci-dessus excepté que chaque amorce PIDI-2S et Adpat est ajustée à une concentration finale de 0,3 µM. Pour le programme d’amplification seule la température d’hybridation diffère par rapport à la PCR initiale avec une température d’hybridation de 55°C .

Tableau 13 : Oligonucléotides spécifiques ciblant la queue poly A et le domaine III de la sous-unité principale α du canal sodium de la blatte P. americana.

Région Transcrit

d’intérêt

Nom des amorces

Séquence nucléique des oligonucléotides Tm (°C)

Adapt (dT)20 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)₂₀-3’ 50 Adapt 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’ 66 M1505S 5’-GTAYYTNTAYTTYGTNTTYTTYATHATHTTYGG-3’ 50 P1D3-AS1 5’-CGCAAGCCTGATAATGAGCTGG-3’ 65 3’ non codant Adaptateur de la queue polyA Sous-unité α

L’oligonucléotide Adapt (dT)₂₀ a été conçu de manière à être à la fois complémentaire de la queue polyA de l’ADNc double brin en première PCR et de l’oligonucléotide Adapt en seconde PCR. Tm correspond à la température de fusion des amorces déterminée selon la formule 4GC+2AT.