Mise en oeuvre des méthodologies

1.3.1. Histologie de routine.

Les lames colorées à l’Hématéine-Eosine-Safran (HES) ayant servi au diagnostic histologique initial ont été systématiquement relues par un pathologiste unique. Celui-ci a plus particulièrement vérifié le type histologique de la tumeur et son grading suivant l’OMS.¹. Le diagnostic initial a pu ainsi être confirmé dans tous les cas, tandis que la classification TNM initiale a été modifiée selon la dernière version en cours (41). Au cours de la relecture des lames faite lors de ce travail, l’étude histologique de la muqueuse non tumorale adjacente à la tumeur et à distance de la tumeur, a été reprise de façon détaillée, et l’index mitotique a systématiquement été réévalué suivant un protocole défini précisément au moment de l’étude.

1.3.1.1. Muqueuse non tumorale adjacente et à distance de la tumeur. Pour chacun des 57 patients atteints d’un CCR, la muqueuse non tumorale a fait l’objet d’une étude histologique classique sur lame entière, d’une part en contiguïté avec la tumeur, d’autre part à distance de la tumeur.

Au moyen d’un oculaire micrométrique monté sur le microscope, nous avons mesuré un fragment de 12 mm de long à partir de la tumeur. Cette longueur correspond, avec l’objectif x20, à 800 graduations de l’oculaire micrométrique. Ce fragment a été divisé en 3 séquences consécutives de 4mm. Sur chacune de ces séquences nous avons pratiqué 5 mesures de l’épaisseur moyenne de la muqueuse, et compté le nombre d’abouchements des cryptes et le nombre de cryptes anormales. Pour les lames comportant une tumeur, la première séquence a été choisie au contact de la tumeur, en prenant soin de ne considérer que les lames comportant un plan de coupe longitudinal le plus parfait possible ; 25 lames, seulement répondaient à ces critères et ont pu être mesurées ; pour ces lames, la séquence au contact de la tumeur nous a permis d’établir l’aspect de la muqueuse au contact immédiat de la tumeur, l’analyse de la séquence intermédiaire et de la séquence terminale nous ont permis d’observer un retour progressif éventuel à l’état de muqueuse normale.

1 Pour rappel :

grade 1 : bien différencié, contenant plus de 95% de structures glanduliformes ; grade 2 : modérément différencié, contenant de 50 à 95% de structures glanduliformes ; grade 3 : peu différencié, contenant moins de 50% de structures glanduliformes.

Pour les lames ayant intéressé la muqueuse à distance de la tumeur, la première séquence a été déterminée de façon à intéresser obligatoirement un segment de coupe parfaitement longitudinal¹. 25 lames satisfaisant à ces critères ont également pu être examinées.

1.3.1.2. Détermination de l’index mitotique.

L’index mitotique, déterminé par le compte des mitoses, a été considéré comme le marqueur des cellules en prolifération (ou cellules proliférantes) , par opposition au Ki-67, marqueur des cellules en phase active du cycle cellulaire. Les mitoses apparaissent comme des images d’extensions chevelues représentant les chromosomes, ou en boules lorsque les chromosomes sont en début de métaphase, en deux boules lors de la télophase, ou encore de façon très caractéristique, plus ou moins étalés sur un plan (plaque équatoriale lors de la métaphase ; ces images s’observent dans des cellules ayant perdu leur membrane nucléaire et comportant un cytoplasme classiquement basophile (critères de Van Diest et Baak, (149)). Les mitoses ont été comptées pour chaque échantillon de façon indépendante dans chaque zone d’intérêt (zone de spotting virtuel qui fait l’objet par ailleurs d’une description détaillée) sur 10 champs successifs au grossissement x40. Le chiffre le plus élevé a été retenu comme représentatif du compte des mitoses de la lame entière, en se rapportant à la pratique usuelle de compter les mitoses sur lame entière dans la zone la plus riche en mitoses lors de l’observation au grossissement x25. L’index mitotique a ensuite été établi en reportant le nombre des mitoses sur des abaques prenant en compte la surface du champ du microscope au grossissement x40 ¹.

1.3.2. Etude Immuno-histochimique.

Pour l’étude immuno-histochimique, quatre marqueurs, l’antigène Ki-67, la β-caténine, la Cycline D1 et le Bcl-2 ont été choisis pour évaluer le cycle cellulaire.

1.3.2.1. Choix des marqueurs.

L’antigène Ki-67, exprimé par les noyaux des cellules en phase G1 tardive, et dans les phases G2, S et M mais absent de la phase G0, est un marqueur des cellules en phase active du cycle et susceptibles de proliférer (cellules prolifératives). C’est à ce titre qu’il a été retenu dans ce travail. Il a été déterminé au moyen de l’anticorps Mib1 dirigé contre lui.

Les autres marqueurs ont été choisis en fonction de leur importance dans le processus de cancérogénèse colique : la β-caténine a été retenue comme premier marqueur du fait de son rôle-clé dans la voie Wnt de la cancérogénèse colique, et pour son implication dans la différenciation cellulaire ; la Cycline D1 a été retenue comme cible privilégiée de la β

-caténine dans l’activation de la prolifération cellulaire. Ces deux marqueurs ont été

détectés au moyen d’anticorps spécifiques contre la β-caténine et la Cycline D1.

L’antigène anti-apoptotique Bcl-2 a également été étudié, comme témoin indirect de l’apoptose. Le tableau des différents anticorps et de leurs concentrations figure en annexe (annexe 3).

1.3.2.2. Réalisation du marquage immuno-histochimique sur coupes de tissus. L’étude immuno-histochimique a été pratiquée sur coupes entières de la tumeur, de la région à cheval entre tumeur et tissu non tumoral, et du tissu sain à distance de la tumeur. Le marquage immuno-histochimique des coupes a été fait suivant les méthodes classiques, sur les coupes entières de tumeurs, sur les coupes intéressant la muqueuse à cheval entre tumeur et tissu sain, et sur la muqueuse normale à distance de la tumeur.

1.3.2.3. Lecture des marquages.

Chaque lame a fait l’objet d’une lecture « classique » champ après champ, de la lame entière.

En outre les lésions dysplasiques et cancéreuses ont bénéficié d’une lecture indépendante de trois zones réduites correspondant chacune approximativement à 10 champs contigus du microscope Polyvar au grossissement 400 et choisies par le pathologiste en fonction de leur topographie particulière dans la lésion.

Ces zones ont été arbitrairement appelées « zones de spotting virtuel ». Les zones de spotting virtuel ont été déterminées comme suit sur la lame entière (figure 24) :

1sur le microscope à grand champ Polyvar de Reichert-Jung sur lequel l’étude a été faite, le diamètre est de 0,63 mm et la surface, de 0,620 mm2..

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TUMEUR