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METHODES ET MATERIEL

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Conditions d'incubation :

On indiquera ici la composition du milieu d'incubation le plus fréquemment utilisé, et on spécifiera les inodifications de ces conditions de base en cours d'exposé. Les essais enzymati­ ques sont effectués à 3 7°C pendant 15 minutes. Chaque incuba­ tion contient, dans; un volume total de 0, 5 ml, 0, 73 mM de gluco-

sylcéramide, 0,50 mM d'UDP-galactose-U-^"^C (l), correspon­

dant à environ 600.000 cpm (O, l^C), MnCl

2

15 mM, 0,4 % d'iso-

octylphenoxypolyoxyéthanl (Cutscum) (2), un détergent non ionique,

0

, 15 ml d'une suspension de microsomes correspondant approxi­

mativement à 1,

6

mg de protéines (3) et une solution tampon de

3

,

3

-diméthylglutarate 53 mM.

Préparation du glucosylcéramide :

Ce sphingoglycolipide s'accumule dans les tissus réticulo­ endothéliaux des patients atteints de la maladie de Gaucher (PHI- LIPART, ROZENSTEIN et MENKES, 1965). Il a été préparé à

(1) International Chemical and Nuclear Corp. , Iruine, California. (2) Fisher Scientific Company, Pittsburgh, Pennsylvania.

partir d'une rate d'un malade atteint de cette affection. Les lipides

totaux du viscère, extraits avec

19

volumes d'un mélange équimo­

laire de chloroforme-méthanol, sont ensuite partagés entre deux

phases par l'addition de

0

,

2

volume d'une solution de

KCl 0,88 % (117 mM) dans l'eau distillée, selon la méthode de FOLCH (FOLCH, LEES et SLOANE STANLEY, 1957). On concen­ tre les lipides de la phase inférieure par évaporation sous vide, et on les place sur une colonne de Florisil (l), à raison de 50 mg de lipides par g de Florisil. L'élution du glucosylcéramide est effec­ tuée avec le mélange chloroforme-méthanol : 95, 5 (v/v), après l'élimination des graisses neutres, par un lavage de la colonne avec du chloroforme. On vérifie la pureté du glucosylc.éramide par la chromatographie en couche mince qui montre une tache unique, don­ nant, en présence de l'anthrone, une coloration bleue caractéristique.

Préparation des microsomes à partir du tissu splénique du rat :

Nous avons utilisé des rats Sprague-Dawley (2) pesant entre 100 et 170 g. Les animaux sont sacrifiés par décapitation, et leur rate, prélevée très rapidement, est homogénéisée dans du sucrose 0, 25 M à 0°C dans un homogénéiseur de Potter-Elvehem. Les mi­ crosomes sont préparés en centrifugeant, à 105. 000 g pendant 60 minutes, le surnageant obtenu après l'élimination des débris cellu­

laires (600 g pendant 10 minutes), des mitochondries (

8

. 500 g

pen-(1) Floridin Company, Thallahassee, Florida.

(2) Charles River Breeding Laboratories, North Wilmington, Massa­ chusetts.

24

-dant 15 minutes) et d'une fraction intermédiaire composée de mito­ chondries, lysosomes et microsomes (deuxième centrifugation à

8

. 500 g pendant 15 minutes). KIYASU et ses collaborateurs ont pré­

cédemment appliqué cette méthode au fractionnement subcellulaire du tissu hépatique (KIYASU et al, 1963). Durant les diverses phases de l'isolement des microsomes, la température de la préparation est maintenue entre 0 et 4°C. La suspension des microsomes est alors soit utilisée immédiatement pour les essais enzymatiques, soit conservée à -15°C. A cette température, l'activité enzymatique étudiée reste stable pendant au moins six semaines.

Technique d'incubation :

On place

l44y^xg

de glucosylcéramide préalablement dissous

dans

0

, 15 ml de chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v) au fond de tubes en

pyrex de 1 5 ml. Ces tubes sont laissés ouverts durant une nuit dans une chambre froide (4°C), de manière à permettre l'évaporation du solvant.

Le lendemain, on y ajoute 0, 300 ml d'un mélange fraîchement préparé, composé de Cl^Mn, du détergent Cutscum (1) et de la solu­ tion tampon. Ensuite, on agite les tubes très vigoureusement, pendant

1

minute, pour disperser le mieux possible le glycolipide dans le mi­

lieu d'incubation. On additionne aux tubes à essais, placés dans de la

(1) Isooctylphenoxypolyoxyéthanol, Fisher Scientific Company, Pittsburgh, Pennsylvania.

glace pilée, 0,05 ml de UDP-galactose-U-^^C, et on déclenche la réaction enzymatique en ajoutant au milieu d'incubation, préala­ blement chauffé à 37°C, 0, 150 ml de la suspension de microsomes. Pendant l'incubation, les tubes, fermés hermétiquement, sont con­ tinuellement agités. On arrête la réaction enzymatique par 10 ml

de chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v), et on effectue la partition en

deux phases de Folch par l'addition de 2, 1 ml d'une solution de

KCL 0,

88

% dans l'eau distillée.

Afin de réduire les pertes du lactosylcéramide radio-actif formé pendant l'incubation dans la phase supérieure, on a ajouté lOO^ig de lactosylcéramide (l) non marqué à chaque tube. Cepen­ dant, cette opération est apparue superflue en cours d'expérimen­ tation, et elle a été abandonnée. Après l'élimination de la première phase supérieure, la phase inférieure est lavée deux fois encore par des volumes adéquats d'un mélange ayant la composition de la phase supérieure théorique : chloroforme-méthanol-eau : 3,48,47 (v/v/v). Par ce procédé, on réussit à éliminer complètement de la phase inférieure l'UDP-galactose radio-actif.

Séparation des produits formés pendant l'incubation :

Après le lavage, on sèche la phase inférieure dans un courant d'azote, et on la redissout dans de petites quantités de

26

-méthanol :

2

,

1

(v/v) que l'on transfère ensuite soigneusement et

complètement sur une plaque de Silica gel G de 0, 25 mm d'épais­ seur. Cette plaque, de 2, 5 cm de largeur, est alors soumise à une chromatographie ascendante dans du chloroforme-méthanol- eau : 65,24,4 (v/v/v). Après la chromatographie, les produits radio-actifs, formés pendant l'incubation, sont localisés sur la plaque de Silica gel G par un scintillographe Packard, modèle 7201.

Mesure de la radio-activité des divers pics :

Chaque région de Silica gel.G correspondant à un pic radio­ actif est prélevée dans une fiole à scintillation et suspendue dans

10

ml de liquide scintillant qui contient, pour

1

litre de toluène,

4, 0 g de 1,4-bis 2-(5-phenyloxazolyl) benzène et 0, 05 g de 2. 4- diphényloxazole et 10 ml de Armeen L-11 (l). En ajoutant à chaque fiole 0,05 ml d'hylène TM-65 (2), on obtient, après agitation de 30

secondes, un gel où le Silica gel G et le produit radio-actif se trou­ vent uniformément suspendus (BOLLINGER et collaborateurs, 1967). La radio-activité des divers pics a pu être mesurée ainsi directe­ ment, avec un rendement égal à celui obtenu en comptant la radio­ activité des produits après leur extraction du Silica gel G. Une élu- tion complète des substances radio-actives du milieu gel G nécessite

trois extractions successives par

10

à

20

volumes de chloroforme-

méthanol-eau : 65, 25, 4 (v/v/v). Chaque fois, on laisse la poudre en contact du solvant pendant 30 minutes, à 37°C. Le produit radio­ actif est ensuite séparé du Silica gel G par centrifugation.

(1) Armour Industrial Chemical Co. , Inc.

(2) Dupont Cy, l'hylène TM-65 est un mélange de toluène 2, 4-diisocya-

Identification des produits radio-actifs :

La quantité de produits radio-actifs synthétisée dans une incubation standard est inférieure à une m^mole, et elle ne per­ met pas une analyse chimique de ceux-ci. Nous avons caractérisé ces substances par la chromatographie sur colonne, la chromato­ graphie en couche mince, l'étude de leur résistance à l'hydrolyse alcaline et la localisation de la radio-activité dans la molécule formée.

Lors de la chromatographie sur colonne de Florisil, les lipides ont été élués, selon la méthode de G. ROUSER (ROUSERet

collaborateurs,

1961

), successivement par le chloroforme plus

5 °]o

de

2

,

2

-diméthoxypropanol, le chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v)

plus

5

% de

2

,

2

-diméthoxypropanol, et enfin le chloroforme-

méthanol :

2

,

1

(v/v) saturé en eau.

La chromatographie en couche mince est effectuée dans les

28

-TABLEAU IV

SYSTEME COUCHE MINCE SOLVANT

(I) Silica gel H T ét r ahydr

0

xyfur an e - méthylal - méthanol -

amoniaque 2N : 50, 25, 25, 1 (v/v/v/v)

(II) Silica gel G n-propanol-eau : 70, 30 (v/v) système des­

cendant

(III) Silica gel H chloroforme-méthanol-amoniaque concen­

tré :

6

, 4, 1 (v/v/v)

(IV) Silica gel G chloroforme-méthanol-eau : 65, 25, 4 (v/v/v)

(V) Silica gel G chloroforme-méthanol-eau : 65, 35, 4 (v/v/v)

(VI) Silica gel H n-propanol-eau-amoniaque concentré :

80, 13. 3,

6

. 7 (v/v/v)

L'hydrolyse alcaline est réalisée suivant le procédé de Dawson

(DAWSON, i

960

). Le produit radio-actif placé dans un ballon de 50

ml est dissout dans 0, 8 ml de tétrachlorure de carbone. On y ajoute ensuite 7, 5 ml d'éthanol, 0, 65 ml d'eau distillée et 0, 25 ml d'une so­ lution aqueuse de NaOH IN. Ce mélange est incubé pendant 30 minutes, à 37°C, et, après l'addition de 0,4 ml de formiate d'éthyle, réincubé à 37°C pendant 5 minutes. On sèche alors l'hydrolysat sous vide à une température ne dépassant pas 60 °C, et on le redissout dans un

La localisation de la radio-activité dans le lipide formé pendant l'incubation a nécessité son clivage en des molécules plus

simples. Après l'extraction du pic B du Silica gel G, on place le matériel obtenu par l'extraction du pic B dans un petit tube en verre pyrex, on ajoute 1, 5 mg de lactosylcéramide non marqué, et on sèche dans un courant d'azote. Après l'addition de 1 ml de HCl 2N anhydre dans du méthanol, on scelle le tube que l'on place à lOO^C, pendant 18 heures. Ensuite, le contenu du tube est trans­ féré dans un petit ballon, et on le sèche sous vide, en ajoutant 3

fois

2

ml d'un mélange de toluène-éthanol :

1

,

1

(v/v), pour faciliter

l'élimination de HCl. Finalement, les produits de la méthanolyse sont placés sur une petite colonne de Charbon-Célite (hauteur ;

1

,5 cm, diamètre :

1

cm), et on élue les sucres avec du méthanol-

eau :

8

,

2

(v/v), et les acides gras plus les sphingosines avec du

chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v). On place ensuite les hydrates de carbone dans un petit tube en verre pyrex, et on les hydrolyse

en présence de 2 ml d'une solution de SO

4

H

2

2N, pendant 18 heures,

à 100°C. Après l'hydrolyse acide, le contenu du tube (sucres) est désionisé sur une colonne d'Amberlite CG45, maintenue sous forme

d'acétate, par élution des produits avec du méthanol-eau :

20

, 80

(v/v). La séparation des divers sucres est obtenue par chromato­ graphie descendante sur papier (Whatman 3 MM) dans le mélange d'acétate d'éthyle, pyridine, eau : 12, 5,4 (v/v/v).

IL RESULTATS

Identification des pics radio-actifs :

30

-dans l'extrait lipidique des incubations standards (phase inférieure de Folch) : un ensemble généralement composé de deux pics, loca­ lisés près de l'origine, le pic A et le pic B. (Fig. 2).

Nous avons identifié ces deux derniers ; le pic A comme galactosyl-galactosyl-glucocéramide, ou triglycosylcéramide, et le pic B comme galactosyl-glucosylcéramide, ou lactosylcéramide.

a) Pic B :

G. HAUSER a montré précédemment que le pic B et le lacto­ sylcéramide authentique migraient ensemble dans quatre système de chromatographie en couche mince (G. HAUSER, 1967). Le présent travail apporte des éléments supplémentaires de caractérisation du pic B.

Le produit qui correspond au pic B est élué d'une colonne de Florisil presque exclusivement dans la fraction chloroforme-méthanol 2, 1 (v/v) plus 5 % de 2, 2-diméthylpropanol (Tableau V, page 32).

Après l'hydrolyse alcaline douce, plus de 96 % de la radio­ activité sont retrouvés dans la phase chloroformique; ce qui démontre la résistance du produit à ce traitement.

La méthanolyse acide suivie de l'hydrolyse acide et de la sé­ paration des sucres par chromatographie sur papier permettent de localiser la radio-activité au niveau du galactose.

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