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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Hildebrand, J. (s.d.). Contribution à l'étude de la synthèse des glycolipides (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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CONTRIBUTION Â L'ETUDE DE

LA SYNTHESE DES GLYCOLIPIDES

SERVICE DE MEDECINE ET D'INVESTIGATION CLINIQUE

DE L'INSTITUT IULES BORDET

CONTRIBUTION A L'ETUDE DE

LA SYNTHESE DES GLYCOLIPIDES

I . HILDEBRAND

SERVICE DE MEDECINE ET D'INVESTIGATION CLINIQUE

DE L'INSTITUT IULES BORDET

Ce travail a été réalisé dans les laboratoires de chimie biologique de l'Université de Harvard et d'investigation clinique du Centre des Tumeurs de l'Université Libre de Brioxelles.

L'auteur voudrait remercier les Professeurs J. FOLCH- PI et H. TAGNON, directeurs de ces laboratoires, pour leurs encouragements et la mise à sa disposition des conditions de tra­ vail les plus favorables.

I. STRUCTURE DES SPHINGOGLYCOLIPIDES

On subdivise habituellement l'ensemble des lipides en quatre groupes. Le premier comprend le cholestérol et ses esters, le second les lipides neutres : les glycérides et les acides gras, le troisième les phospholipides, et le quatrième enfin est celui des sphingoglycolipides. Ces derniers sont constitués d'une molécule de céramide à laquelle se fixe un nombre variable d'hexoses (Fig. 1).

SPHINGOSINE

2

-Les céramides se composent d'une molécule de sphingosine et d'un acide gras unis par une liaison amide. Les acides gras contiennent de 14 à 26 atomes de carbone. Ils peuvent être sa­ turés ou non saturés, hydroxylés ou non. Les molécules de sphingosine diffèrent également entre elles par le nombre des

atomes de carbone (l

6

à

20

), le nombre de groupements hydro-

xyles et par la position de ces derniers par rapport à la double liaison de la sphingosine.

Le groupe alcool primaire en Cj de la sphingosine forme une liaison glycosidique avec le glucose ou le galactose. La chaîne des hydrates de carbone peut contenir en outre d'autres sucres tels que le N-acétyl-galactosamine et exceptionnellement le N-acétylglucosamine (HAKOMORI et STRYCHARZ, 1968) et le fucose (Mc KIBBIN, 1969 et SUZUKI, MAKITA et YOSIZAWA,

1969).

Les sphingoglycolipides diffèrent donc entre eux par le nombre et la nature des sucres, la longueur et le type des acides gras, et la molécule de sphingosine.

Les deux derniers ne se rencontrent que dans quelques ganglio- sides mineurs. Dans les gangliosides, l'acide gras le plus abondant est l'acide stéarique (C^g).

Les sulfatides dérivent du galactosylcéramide ou du

lactosylcéramide par estérification du galactose en C

3

.

Enfin, on peut rattacher à ce groupe des lipides qui ne possèdent pas tous les éléments qui caractérisent les sphingo- glycolipides,

a) La psychosine (galactosylsphingosine) ne contient pas d'acide gras.

b) Le monogalactosyldiglycéride, un lipide récemment isolé de la myéline du système nerveux central, ne renferme pas de sphingosine (STEIM, 1967).

c) La sphingomyéline contient, à la place d'hydrates de carbone, un groupe phosphorylcholine qui la fait ranger habituel­ lement parmi les phospholipides. Elle est un sphingolipide, mais pas un sphingoglycolipide.

II. LOCALISATION ET FONCTION DES SPHINGOGLYCOLIPIDES

4

-1. Mono- et poly-hexosylcéramides (Asialogangliosides),

Ces glycolipides qui ne contiennent pas d'acide N-acétyl- neuraminique sont présents dans un grand nombre d'organes (Tableau l). Ils y apparaissent comme des constituants quantita­

tivement mineurs, et leur poids ne dépasse pas

1

à

2

% dupoids

total des lipides. Cependant, deux tissus sont plus riches en asialogangliosides : la substance blanche et les leucocytes.

REPARTITION DES MONO ET POLY-HEXOSYLCERAMIBES.

ABREVIATIONS :

C

=

céramide

GALNac =

N-acétyl galactosamine

GLU =

glucose

S

=

sulfate

1

.

SUOMI. W.P., Fed, Proc. 23, 375 (1964).

'

'

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19.

MARTENSON, E., Biochim. Biophys. Acta _U6, 296 (1966).

2. Les gangliosides.

La substance grise, qui contient environ 2 mg de gangliosides par g de tissu frais, est l'organe le plus riche en ces lipides. Aussi, c'est à partir du système nerveux central qu'on a isolé et identifié la structure des gangliosides en premier lieu (KUHN, WIEGANDT et

EGGE,

1961

et KLENK et GIELEN, 1963). Quatre composés, leGjviji

le Goia.» le Gpjj^, et le Gq>j (Tableau II) constituent plus de 90 % de l'ensemble des gangliosides cérébraux. Tous les quatre possèdent une chaîne identique d'hexoses et ne diffèrent que par le nombre ou la position des molécules de l'acide N-acétyl neuraminique (NANA). Un cinquième ganglioside, le Gy, pourrait avoir la même chaîne d'be- xoses que les quatre gangliosides majeurs, et 4 molécules de NANA; cependant sa structure n'a pas encore été définitivement établie.

Comme le montre le tableau II, la chaîne des hexoses des autres gan­ gliosides est variable et généralement plus courte, ce qui rend ces composés moins hydrophiles. Parmi ceux-ci, on voudrait attirer l'at­

tention sur la structure du ganglioside Gj

^2

à l'exception du ga­

lactose terminal, est identique à celle du Gj^j. Le ganglioside G2vi2 ne représente que 3 à 6 % des gangliosides du cerveau normal (SVEN-

NERHOLM,

1963

et SUZUKI, 1964), il s'accumule dans le cerveau

des patients atteints de la maladie de TAY-SACHS et dans les viscères,

dans la gangliosidose généralisée (Tableau III).

TABLEAU II

REPARTITION DES GANGLIOSIDES

SYMBOLE TISSUS W GANGLIOSIDES î FORMULE PROPOSEE. O JS J! m

U

a > c-«

2

J ■*—'

c

£ *o

5

c C) •

U

_O bfi O s Oï

a

^ gp g w _{r, -J}Z 1-5 ta CO W to H H U < H CO CO t—4 S < 2 w c rt O 03 U C O S cj _►■4 J H g <: H ^ «

1

w H < S O

B

HU < W »—< HH O S » Uw H

S

w 5 ® « « J O M « J O < O g » U S > Z « O Ü J W CL, h K CL. S « ü 2 c. (1*1) GAL (3*2) NANA 1 1 ®gal 1.2

C. (1*1) GLU (4*1) GAL (3*2) NANA iGj^g

®lact 13 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C. (1*1) GLU (4*1) GAL (3*2) NGNA | 22 3 14 10

C. (1*1) GLU ( 4*1)G.\L (3*2) GALNac ÎG

,^2

Go Gg FM 15, 16 22 12 NANA (2 3)

C. (1*1) GLU (4*1) GAL (3*2) NANA (8*2) NANA ; _°lact 1 22 C. (1*1) GLU (4*1) GAL (4*1) GALNac • _{^GNTrll 1}

NANA (2*3) + 1 NANA !

C. (Ul) GAL (3*1) GAL (3*1) GAL | D 1 + 2 NANA

c. (Ul) GLU (4«.l) GAL (3»1) GALNac (3*1) GAL|Gj^j

NANA (2«-3)*-> ' C. (1*1) GLU (4*1) GAL (3.1) GALNac (3*1) GAL.G^.

NANA (2*3)«-J NANA (2*3) *J ; C. (1.1) GLU (4*1) GAL (3*1) GALNac (3*1) GAL'G--.

NANA (3*2)*zJ , NANA (2*8)LI I C. (1*1) GLU (4*1) GAL (3*1) GALNac (3.1) GALl G_,.

NANA(3*2)L NANA (2*3) ♦-! [ NANA (2*8)^ , TETRASIALOGANGLIOSIDE j GANGLIOSIDES PARTIELLEMENT IDENTIFIES, MIGRANT COMME LES GANGLIOSIDES MAJEURS.

196, 256 (1964).

2. SADDIQUI, B. et Mc CLUER, R. H., J. LipidR.es.,

9,

366 U968).

3. LEDEEN, R., SALMAN, K. et CABRERA, M.,

Biochemistry,

7_,

2287 (1968).

4. KLENK, E. et HEUER, K., Deut. Z. Verdauungs.,

20,

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5. SVENNERHOLM, L., Acta Chem. Scand.,

1506 (1965).

6

. SVENNERHOLM, L., J. Lipid Res., 5, 145 (1964).

7. SVENNERHOLM, L., Acta Chem. Scand. , L7,

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Biochemistry, 435 (1966).

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21.

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24.

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ABREVIATIONS :

C. =

CERAMIDE

GLU =

GLUCOSE

GAL. •=

GALACTOSE

NANA. = ACIDE N-ACETHYL-

NEURAMINIQUE

TABLEAU III

I

LES SPHYNGOGLYCOLIPIDOSES

AFFECTION ANOMALIE BIOCHIMIQUE REFERENCE MECANISME ENZYMATIQUE REFERENCE

PRINCIPALE

FARBER :

CERAMIDE

/

1

INCONNU

KRABBE :

CEREBROSIDE

/

2

CEREBROSIDE-SULFOTRANS-

/

3

SULFATIDE

/

FERASE

GAUCHER :

GLUCOSYLCERAMIDE

/

4

GLUCOSYLCEREBROSIDASE

/

5

FABRY :

TRIGLYCOSYLCERAMIDE

/

6

GALACTOSIDASE (spécifique

du galactose terminal).

/

7

TAY-SACHS :

GANGLIOSIDE G^^2

/

8

HEXOSAMINIDASE (composant A) /

9

GANGLIOSIDOSE G^g •

(Sandhoff)

GANGLIOSIDE Gj^2

/

10

HEXOSAMINIDASE (composants

A et B)

/

10

GANGLIOSIDOSE G^^^ :

GANGLIOSIDE

/

11

yâ -GALACTOSIDASE

/

12

GANGLIOSIDOSE Gj^^^

(limitée au cerveau)

GANGLIOSIDE G^^^

/

13

INCONNU

SPHYNGOMYELINASE (types A

NIEMANN-PICK ;

SPHYNGOMYELINE

/

14

/

15

CHOLESTEROL

/

INCONNU (types C et D)

FUCOSIDOSE :

PENTAHEXOSYL-CERAMIDE

(contenant du fucose)

/

16

oC L-FUCOSIDASE

/

17

LEUCODYSTROPHIE : .

MET ACHROMATIQUE ‘

SULFATIDE

/

18

CEREBROSIDE-SULFATASE

/

19

Galactosyl-galactosyl-glucosylcéramide. Classification de Crocker.

f

augmenté

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12

-gangliosides s'accumulent principalement dans la membrane des neurones, et les expériences de fractionnement subcellulaire les localisent dans la membrane des synaptosomes (LAPETINA, SOTO

et DE ROBERTIS, 1967). Ces résultats ont conduit Mc ILWAIN (1966) attribuer aux gangliosides un rôle important dans le transport des cations à travers la membrane neuronale. Il s'agit là d'une hypo­ thèse intéressante, mais qui n'a pas encore reçu de confirmations expérimentales.

Des gangliosides ont été trouvés dans d'autres organes d'origine nerveuse (Tableau II). Ea rétine contient environ 0, 45 mg et la glande médullosurrénale 0, 84 mg par g de tissu frais.

On a longtemps considéré que, en dehors du système ner­ veux et de ses dérivés, les gangliosides étaient présents en très faibles quantités et avaient une structure relativement plus simple que ceux du cerveau.

III. SPHINGOGLYCOLIPIDE EN PATHOLOGIE HUMAINE

a) Les sphingolipidoses.

Ce groupe de maladies a été l'objet d'études multiples au cours des dix dernières années. Celles-ci ont permis, non seule­ ment de caractériser chimiquement un certain nombre d'affections, mais encore de mieux comprendre la structure et le métabolisme des sphingolipides normaux. Des articles de revue récents, dont celui de PHILIPPART (1969) traitent ce sujet en détails. Nous nous bornerons ici à résumer, dans un tableau (Tableau IIl), les princi­ pales sphingolipidoses et leurs caractéristiques biochimiques. La liste de ces syndromes n'est pas close; d'autres lipidoses viendront

certainement s'y ajouter. On peut s'attendre, en outre, à la mise en évidence de différences biochimiques au sein de maladies telles que celles de GAUCHER ou de NIEMANN-PICK, dont les formes cliniques très variées correspondent vraisemblablement à des ano­ malies biochimiques que nous sommes encore incapables de distin­ guer. La différence du déficit enzymatique entre la maladie de TAY-

SACHS et la gangliosidose généralisée ^M

2

montre combien ces dis­

14

-Tout autre est le cas de thésaurismoses mixtes où les sphingoglycolipides s'accumulent avec d'autres substances telles que les mucopolysaccharides, comme c'est le cas, par exemple, dans la maladie de HURLER ou celle de HUNTER. La fréquence avec laquelle les deux types de composés sont présents chez le même patient est surprenante s'il fallait admettre l'existence, chez un individu, de deux troubles enzymatiques dont chacun en soi est très rare. La pathogénie de ces affections s'explique plus aisément si on postule que les mêmes enzymes interviennent dans le catabolisme des sphingoglycolipides et des mucopolysaccharides. Une telle hypothèse est séduisante, mais elle n'a pas encore été démontrée expérimentalement.

b) Sphingolipides dans les tissus néoplasiques.

Dès i

960

, M. M. RAPPORT et ses collaborateurs ont mon­

tré que les anticorps produits par les lapins en réponse à l'injection des broyats de tumeurs réagissent beaucoup plus intensément avec les extraits lipidiques de ces tumeurs qu'avec des extraits identiques d'organes sains. Ce groupe de chercheurs a pu ensuite identifier le lipide antigénique, appelé cytolipin H, comme un sphingoglycolipide composé d'une molécule de sphingosine, d'un acide gras, d'une molé­ cule de glucose et d'une de galactose (RAPPORT, GRAF et YARIV,

1961

). Plus tard, la présence des sphingoglycolipides fut mise en

évidence dans des tissus néoplasiques variés (GRAY, 1965 et KAWA- NAMI et TSUJI, 1968a). Ceux-ci peuvent s'accumuler en quantité anormalement grande dans certains cancers (KAWANAMI et TSUJI,

particulière (HAKOMORI, 1964).

Récemment enfin, des modifications importantes de la com­ position des gangliosides ont été observées dans divers types de celltiles lors de leur transformation maligne induite par des agents virusaux (BRADY, BOREK et BRADLEY, 1969 et MORA, BRADY, BRADLEY et Mc FERLAND, 1969). Ces résultats sont à rapprocher des observations d'AMBROSE (1966) qui a trouvé des concentrations accrues d'acide neuraminique dans les membranes plasmatiques des cellules néoplasiques. Cet auteur attribue à cette anomalie certaines propriétés des cellules malignes, comme la capacité de métastasier. Dans leur ensemble cependant, les études des sphingoglycolipides dans les tumeurs restent peu nombreuses et ne permettent pas encore de tirer des conclusions définitives concernant le rôle de ces lipides dans les tissus cancéreux. Elles nous fournissent néanmoins deux in­ dications importantes. D'autre part, certains tissus néoplasiques contiennent des sphingolipides particuliers qui pourraient être x-espon- sables des propriétés anormales des membranes des cellules cancé­ reuses. De plus, la présence de ces sphingoglycolipides peut confé­ rer aux membranes plasmatiques des cellules malignes des proprié­ tés antigéniques nouvelles.

Cette dernière possibilité revêt une importance particulière à un moment où il apparaît clairement que l'organisme est capable de produire des anticorps contre le cancer, et où l'immunothérapie dans certaines affections néoplasiques est appliquée avec un certain

16

-BUTS ET PLANS DU TR.AVAIL

Cette étude comporte deux parties. La première est consa­ crée à l'étude des voies de la formation des sphingoglycolipides.

L'étude de la biosynthèse des sphingoglycolipides a été en­ treprise à la suite du travail de G. HAUSER (1967) qui a démontré la formation du lactosylcéramide après l'incubation du glucosylcé- ramide avec l'UDP-galactose marqué et un homogénat de la rate du rat, utilisé comme source d'enzyme. Un second produit radio-actif était également formé durant l'incubation. La synthèse du lactosyl­ céramide était la dernière étape encore inconnue dans la biosynthèse des gangliosides à partir des céramides.

En commençant ce travail, nous poursuivions un triple but :

- Caractériser plus complètement le produit formé par incubation du gliicosylcéramide et de l'UDP-galactose avec l'homogénat spléni­ que et établir les paramètres cinétiques de cette réaction.

- Identifier le second produit radio-actif formé pendant l'incubation du glucosylcéramide avec l'UDP-galactose en présence d'homogé- nats de la rate du rat.

Au cours du travail, on a pu démontrer que ce second pro­ duit était également un sphingoglycolipide : le galactosyl-galactosyl- glucosylcéramide,

A la suite de cette observation, nous avons entrepris, dans le but de mieux comprendre le méchanisme de la biosynthèse des glycolipides, l'étude de :

- La distinction de ces deux galactosyltransférases entre elles.

- La spécificité de ces deux enzymes à l'égard des divers sphingo­ lipides et leur différentiation avec des galactosyltransférases du

cerveau et de la rate qui catalysent, à d'autres niveaux, la synthèse des sphingoglycolipides.

18

-PLAN DE LA PARTIE EXPERIMENTALE

PREMIERE PARTIE Contribution à l'étude de la biosynthèse des sphingoglycolipides.

CHAPITRE I : Catalyse de la synthèse in vitro du lactosyl- céramide par une galactosyltransférase de la rate du rat.

CRA.PITRE II : Catalyse de la synthèse in vitro du triglyco- sylcéramide par une galactosyltransférase de la rate du rat.

CHAPITRE III : Spécificité, répartition cellulaire et inhibition des galactosyltransférases de la rate du rat,

CHAPITRE IV : Catalyse de la synthèse in vitro du lactosyl-céramide par une galactosyltransférase ducer- veaudu rat.

DEUXIEME PARTIE

CHAPITRE VI Etude des sphingoglycolipides des leucocytes

20

-CHAPITRE I.

CATALYSE DE LA SYNTHESE IN VITRO DU GALACTOSYL- GLUCOSYL-CERAMIDE (LACTOSYLCERAMIDE) PAR UNE GALACTOSYLTRANSFERASE DE LA RATE DU RAT.

L'étude de la synthèse des sphingoglycolipides peut être abordée par des expériences in vivo ou in vitro.

cider les voies de la biosynthèse de ces lipides, un second groupe de travaux a été entrepris. Dans ces expériences, on injecte aux animaxix des sphingolipides radio-actifs de structure simple, et on recherche leur incorporation dans des lipides plus complexes,

KENFER (

1965

) a administré, par voie intrapéritonéale, du gluco-

sylcéramide marqué à des rats âgés de 10 jours. KOPACZYK et

RADIN (

1965

) ont utilisé la psychosine et le céramide radio-actifs

en injection intrathécale. Cependant, dans aucune de ces expérien­ ces, on n'a pu mettre en évidence la formation des sphingolipides à partir de ces précurseurs dans les organes tels que le cerveau, le rein, le foie ou la rate. Il est possible que les substrats aient pu être détruits, principalement dans le foie, et qu'ils n'aient pu at­ teindre le site de la synthèse des glycolipides complexes. En effet, la radio-activité injectée a été retrouvée dans des lipides plus sim­ ples tels que les acides gras et la sphingosine.

22

-qui catalyse sa formation.

I. METHODES ET MATERIEL

Conditions d'incubation :

On indiquera ici la composition du milieu d'incubation le plus fréquemment utilisé, et on spécifiera les inodifications de ces conditions de base en cours d'exposé. Les essais enzymati­ ques sont effectués à 3 7°C pendant 15 minutes. Chaque incuba­ tion contient, dans; un volume total de 0, 5 ml, 0, 73 mM de gluco-

sylcéramide, 0,50 mM d'UDP-galactose-U-^"^C (l), correspon­

dant à environ 600.000 cpm (O, l^C), MnCl

2

15 mM, 0,4 % d'iso-

octylphenoxypolyoxyéthanl (Cutscum) (2), un détergent non ionique,

0

, 15 ml d'une suspension de microsomes correspondant approxi­

mativement à 1,

6

mg de protéines (3) et une solution tampon de

3

,

3

-diméthylglutarate 53 mM.

Préparation du glucosylcéramide :

Ce sphingoglycolipide s'accumule dans les tissus réticulo­ endothéliaux des patients atteints de la maladie de Gaucher (PHI- LIPART, ROZENSTEIN et MENKES, 1965). Il a été préparé à

(1) International Chemical and Nuclear Corp. , Iruine, California. (2) Fisher Scientific Company, Pittsburgh, Pennsylvania.

partir d'une rate d'un malade atteint de cette affection. Les lipides

totaux du viscère, extraits avec

19

volumes d'un mélange équimo­

laire de chloroforme-méthanol, sont ensuite partagés entre deux

phases par l'addition de

0

,

2

volume d'une solution de

KCl 0,88 % (117 mM) dans l'eau distillée, selon la méthode de FOLCH (FOLCH, LEES et SLOANE STANLEY, 1957). On concen­ tre les lipides de la phase inférieure par évaporation sous vide, et on les place sur une colonne de Florisil (l), à raison de 50 mg de lipides par g de Florisil. L'élution du glucosylcéramide est effec­ tuée avec le mélange chloroforme-méthanol : 95, 5 (v/v), après l'élimination des graisses neutres, par un lavage de la colonne avec du chloroforme. On vérifie la pureté du glucosylc.éramide par la chromatographie en couche mince qui montre une tache unique, don­ nant, en présence de l'anthrone, une coloration bleue caractéristique.

Préparation des microsomes à partir du tissu splénique du rat :

Nous avons utilisé des rats Sprague-Dawley (2) pesant entre 100 et 170 g. Les animaux sont sacrifiés par décapitation, et leur rate, prélevée très rapidement, est homogénéisée dans du sucrose 0, 25 M à 0°C dans un homogénéiseur de Potter-Elvehem. Les mi­ crosomes sont préparés en centrifugeant, à 105. 000 g pendant 60 minutes, le surnageant obtenu après l'élimination des débris cellu­

laires (600 g pendant 10 minutes), des mitochondries (

8

. 500 g

pen-(1) Floridin Company, Thallahassee, Florida.

24

-dant 15 minutes) et d'une fraction intermédiaire composée de mito­ chondries, lysosomes et microsomes (deuxième centrifugation à

8

. 500 g pendant 15 minutes). KIYASU et ses collaborateurs ont pré­

cédemment appliqué cette méthode au fractionnement subcellulaire du tissu hépatique (KIYASU et al, 1963). Durant les diverses phases de l'isolement des microsomes, la température de la préparation est maintenue entre 0 et 4°C. La suspension des microsomes est alors soit utilisée immédiatement pour les essais enzymatiques, soit conservée à -15°C. A cette température, l'activité enzymatique étudiée reste stable pendant au moins six semaines.

Technique d'incubation :

On place

l44y^xg

de glucosylcéramide préalablement dissous

dans

0

, 15 ml de chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v) au fond de tubes en

pyrex de 1 5 ml. Ces tubes sont laissés ouverts durant une nuit dans une chambre froide (4°C), de manière à permettre l'évaporation du solvant.

Le lendemain, on y ajoute 0, 300 ml d'un mélange fraîchement préparé, composé de Cl^Mn, du détergent Cutscum (1) et de la solu­ tion tampon. Ensuite, on agite les tubes très vigoureusement, pendant

1

minute, pour disperser le mieux possible le glycolipide dans le mi­

lieu d'incubation. On additionne aux tubes à essais, placés dans de la

glace pilée, 0,05 ml de UDP-galactose-U-^^C, et on déclenche la réaction enzymatique en ajoutant au milieu d'incubation, préala­ blement chauffé à 37°C, 0, 150 ml de la suspension de microsomes. Pendant l'incubation, les tubes, fermés hermétiquement, sont con­ tinuellement agités. On arrête la réaction enzymatique par 10 ml

de chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v), et on effectue la partition en

deux phases de Folch par l'addition de 2, 1 ml d'une solution de

KCL 0,

88

% dans l'eau distillée.

Afin de réduire les pertes du lactosylcéramide radio-actif formé pendant l'incubation dans la phase supérieure, on a ajouté lOO^ig de lactosylcéramide (l) non marqué à chaque tube. Cepen­ dant, cette opération est apparue superflue en cours d'expérimen­ tation, et elle a été abandonnée. Après l'élimination de la première phase supérieure, la phase inférieure est lavée deux fois encore par des volumes adéquats d'un mélange ayant la composition de la phase supérieure théorique : chloroforme-méthanol-eau : 3,48,47 (v/v/v). Par ce procédé, on réussit à éliminer complètement de la phase inférieure l'UDP-galactose radio-actif.

Séparation des produits formés pendant l'incubation :

Après le lavage, on sèche la phase inférieure dans un courant d'azote, et on la redissout dans de petites quantités de

26

-méthanol :

2

,

1

(v/v) que l'on transfère ensuite soigneusement et

complètement sur une plaque de Silica gel G de 0, 25 mm d'épais­ seur. Cette plaque, de 2, 5 cm de largeur, est alors soumise à une chromatographie ascendante dans du chloroforme-méthanol- eau : 65,24,4 (v/v/v). Après la chromatographie, les produits radio-actifs, formés pendant l'incubation, sont localisés sur la plaque de Silica gel G par un scintillographe Packard, modèle 7201.

Mesure de la radio-activité des divers pics :

Chaque région de Silica gel.G correspondant à un pic radio­ actif est prélevée dans une fiole à scintillation et suspendue dans

10

ml de liquide scintillant qui contient, pour

1

litre de toluène,

4, 0 g de 1,4-bis 2-(5-phenyloxazolyl) benzène et 0, 05 g de 2. 4- diphényloxazole et 10 ml de Armeen L-11 (l). En ajoutant à chaque fiole 0,05 ml d'hylène TM-65 (2), on obtient, après agitation de 30

secondes, un gel où le Silica gel G et le produit radio-actif se trou­ vent uniformément suspendus (BOLLINGER et collaborateurs, 1967). La radio-activité des divers pics a pu être mesurée ainsi directe­ ment, avec un rendement égal à celui obtenu en comptant la radio­ activité des produits après leur extraction du Silica gel G. Une élu- tion complète des substances radio-actives du milieu gel G nécessite

trois extractions successives par

10

à

20

volumes de chloroforme-

méthanol-eau : 65, 25, 4 (v/v/v). Chaque fois, on laisse la poudre en contact du solvant pendant 30 minutes, à 37°C. Le produit radio­ actif est ensuite séparé du Silica gel G par centrifugation.

(1) Armour Industrial Chemical Co. , Inc.

(2) Dupont Cy, l'hylène TM-65 est un mélange de toluène 2, 4-diisocya-

Identification des produits radio-actifs :

La quantité de produits radio-actifs synthétisée dans une incubation standard est inférieure à une m^mole, et elle ne per­ met pas une analyse chimique de ceux-ci. Nous avons caractérisé ces substances par la chromatographie sur colonne, la chromato­ graphie en couche mince, l'étude de leur résistance à l'hydrolyse alcaline et la localisation de la radio-activité dans la molécule formée.

Lors de la chromatographie sur colonne de Florisil, les lipides ont été élués, selon la méthode de G. ROUSER (ROUSERet

collaborateurs,

1961

), successivement par le chloroforme plus

5

°]o

de

2

,

2

-diméthoxypropanol, le chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v)

plus

5

% de

2

,

2

-diméthoxypropanol, et enfin le chloroforme-

méthanol :

2

,

1

(v/v) saturé en eau.

La chromatographie en couche mince est effectuée dans les

28

-TABLEAU IV

SYSTEME COUCHE MINCE SOLVANT

(I) Silica gel H T ét r ahydr

0

xyfur an e - méthylal - méthanol -

amoniaque 2N : 50, 25, 25, 1 (v/v/v/v)

(II) Silica gel G n-propanol-eau : 70, 30 (v/v) système des­

cendant

(III) Silica gel H chloroforme-méthanol-amoniaque concen­

tré :

6

, 4, 1 (v/v/v)

(IV) Silica gel G chloroforme-méthanol-eau : 65, 25, 4 (v/v/v)

(V) Silica gel G chloroforme-méthanol-eau : 65, 35, 4 (v/v/v)

(VI) Silica gel H n-propanol-eau-amoniaque concentré :

80, 13. 3,

6

. 7 (v/v/v)

L'hydrolyse alcaline est réalisée suivant le procédé de Dawson

(DAWSON, i

960

). Le produit radio-actif placé dans un ballon de 50

ml est dissout dans 0, 8 ml de tétrachlorure de carbone. On y ajoute ensuite 7, 5 ml d'éthanol, 0, 65 ml d'eau distillée et 0, 25 ml d'une so­ lution aqueuse de NaOH IN. Ce mélange est incubé pendant 30 minutes, à 37°C, et, après l'addition de 0,4 ml de formiate d'éthyle, réincubé à 37°C pendant 5 minutes. On sèche alors l'hydrolysat sous vide à une température ne dépassant pas 60 °C, et on le redissout dans un

La localisation de la radio-activité dans le lipide formé pendant l'incubation a nécessité son clivage en des molécules plus

simples. Après l'extraction du pic B du Silica gel G, on place le matériel obtenu par l'extraction du pic B dans un petit tube en verre pyrex, on ajoute 1, 5 mg de lactosylcéramide non marqué, et on sèche dans un courant d'azote. Après l'addition de 1 ml de HCl 2N anhydre dans du méthanol, on scelle le tube que l'on place à lOO^C, pendant 18 heures. Ensuite, le contenu du tube est trans­ féré dans un petit ballon, et on le sèche sous vide, en ajoutant 3

fois

2

ml d'un mélange de toluène-éthanol :

1

,

1

(v/v), pour faciliter

l'élimination de HCl. Finalement, les produits de la méthanolyse sont placés sur une petite colonne de Charbon-Célite (hauteur ;

1

,5 cm, diamètre :

1

cm), et on élue les sucres avec du méthanol-

eau :

8

,

2

(v/v), et les acides gras plus les sphingosines avec du

chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v). On place ensuite les hydrates de carbone dans un petit tube en verre pyrex, et on les hydrolyse

en présence de 2 ml d'une solution de SO

4

H

2

2N, pendant 18 heures,

à 100°C. Après l'hydrolyse acide, le contenu du tube (sucres) est désionisé sur une colonne d'Amberlite CG45, maintenue sous forme

d'acétate, par élution des produits avec du méthanol-eau :

20

, 80

(v/v). La séparation des divers sucres est obtenue par chromato­ graphie descendante sur papier (Whatman 3 MM) dans le mélange d'acétate d'éthyle, pyridine, eau : 12, 5,4 (v/v/v).

IL RESULTATS

Identification des pics radio-actifs :

30

-dans l'extrait lipidique des incubations standards (phase inférieure de Folch) : un ensemble généralement composé de deux pics, loca­ lisés près de l'origine, le pic A et le pic B. (Fig. 2).

Nous avons identifié ces deux derniers ; le pic A comme galactosyl-galactosyl-glucocéramide, ou triglycosylcéramide, et le pic B comme galactosyl-glucosylcéramide, ou lactosylcéramide.

a) Pic B :

G. HAUSER a montré précédemment que le pic B et le lacto­ sylcéramide authentique migraient ensemble dans quatre système de chromatographie en couche mince (G. HAUSER, 1967). Le présent travail apporte des éléments supplémentaires de caractérisation du pic B.

Le produit qui correspond au pic B est élué d'une colonne de Florisil presque exclusivement dans la fraction chloroforme-méthanol 2, 1 (v/v) plus 5 % de 2, 2-diméthylpropanol (Tableau V, page 32).

Après l'hydrolyse alcaline douce, plus de 96 % de la radio­ activité sont retrouvés dans la phase chloroformique; ce qui démontre la résistance du produit à ce traitement.

ORIGINE. '

' PIC A

Figure 2 : Scintillogramme d'une chromatographie en couche mince

de l'extrait lipidique obtenu après l'incubatip|i, du

glucosylcéramide avec l'UDP-galactose-U- "^C(0, 2 ;aC). La chromatographie est effectuée sur plaque de Silica Gel G dans un mélange de CHCl„-CH„OH-H O, (65,25, 4).

-

DC

-TABLEAU V

Elution du pic B d'une colonne de Florisil.

Enfin, un pic radio-actif est mis en évidence dans la région où migre le lactosylcéramide, après l'incubation de glucosylcéra- mide radio-actif (l) avec de l'UDP-galactose non marqué. Dans cette expérience, le pic de glucosylcéramide (50.000 cpm) masque, sur le scintillogramme, celui du lactosylcéramide (une centaine de cpm) formé pendant l'incubation. En effet, les positions où migrent les deux glycolipides ne sont distantes que d'environ 20 mm. Cepen­ dant, en réunissant les produits marqué élués de la région où migre le lactosylcéramide de cinq expériences différentes, et en les sou­ mettant à une nouvelle chromatographie en couche mince, il est pos­

sible de démontrer la présence d'un pic dans la région du lactosyl­ céramide. Ce pic est distinct de celui qui correspond au glucosyl­ céramide (Fig. 3).,

b) Pic A ;

Les caractéristiques du pic A, obtenu dans les incubations où le glucosylcéramide est employé comme accepteur du galactose, sont identiques à celles du pic A obtenu à partir du lactosylcéramide exogène. Dans les deux types d'expériences, le pic A est identifié comme le galactosyl-galactosyl-glucosylcéramide. On trouveral'é- tude de cette identification dans le chapitre suivant.

c) Les pics présents près de l'origine :

Ces pics, au nombre de un ou deux, n'ont pas encore été identifiés. Cependant, on a pu démontrer que leur importance est

34

-Figure 3(a) : Mise en évidence de la formation d'un produit radio-actif

qui migre comme le lac^gsylcéramide après une incu­ bation du N-stéaroyl-1- C-glucosylsphingosine et du

UDP-galactose non radio-actif.

proportionnelle au temps d'incubation. En revanche, ils sont indé­ pendants de la quantité de glucosylcéramide présente dans les incu­ bations. Cette dernière observation indique qu'il ne s'agit proba­ blement pas de sphingoglycolipides.

Localisation subcellulaire de l'activité enzymatique :

La fraction microsomiale possède l'activité enzymatique spé­ cifique la plus élevée. Celle-ci est environ 5 fois plus élevée que celle de l'homogénat entier. Par unité de poids de tissu splénique, 65 % de l'activité enzymatique sont présents dans la fraction micro­ somiale. L'activité spécifique de la fraction intermédiaire, compo­ sée de mitochondries, lysosomes et microsomes, est deux fois plus élevée que celle de l'homogénat total, tandis que le surnageant est

pratiquement dépourvu de toute activité (Tableau VI, page 3

6

).

Détermination des conditions optimales pour la synthèse in vitro du lactosylcéramide à partir de glucosylcéramide et de 1 'UDP-galactose ;

36

-TABLEAU VI

DISTRIBUTION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE DANS LES FRACTIONS SUB-CELLULAIRES DE LA RATE DU RAT,

Les conditions d'incubation sont données dans les " méthodes

Les différentes fractions utilisées comme sources d'enzymes ont été préparées à partir de quantités équivalentes du tissu splénique.

Les résultats sont la moyenne de 3 expériences.

Incorporation du galactose dans Fraction CDU ^ CTH Homogenat entier 600 X g (débris) 8500 X g (mitochondries) 8500 X g (seconde centrifu- -gation) 105, 000 X g (microsomes) Surnageant CDH = Lactosylceramide CTII = Triglycosylceramide

ppmoles/mg protéine^lS min.

lactosylcéramide(0.40 mM) pour l'étude des paramètres cinétiques de la synthèse du triglycosylcéramide. Dans ce chapitre, seuls les paramètres de la réaction qui aboutit à la synthèse du lactosyl­

céramide à partir du glucosylcéramide sont analysés.

a) Présence du détergent :

La présence d'un détergent est nécessaire dans la plupart des expériences de synthèse des lipides réalisées in vitro. Ceux- ci agissent probablement en favorisant la dispersion du lipide ac­ cepteur dans un milieu aqueux et favorisent le contact entre ce der­ nier et l'enzyme.

Nous avons testé plusieurs détergents. Le Cutscum est ap­ paru le plus efficace. En son absence, nous n'avons décelé aucune incorporation du galactose marqué dans le lactosylcéramide. Des concentrations croissantes de Cutscum, jusqu'à 0,2 %, stimulent la formation du lactosylcéramide, puis un plateau est atteint. (Fig. 4).

b) Rôle de l'ion Mn :

38

-'UJ

ÛC

O

a.

Figure 4 : Effet du détergent Cutscum sur la formation du

m

;j

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

!N

C

O

R

P

O

R

É

s

/m

g

P

R

0

T

E

lN

E

^

/l

5

4H"

Figure 5 : Effets de la présence des ions Mn et Mg sur la formation du

lactosylcéramide (CDH) et du triglicosylcéramide (CTH) à partir

• - du gliicosylcéramide exogène. Les autres conditions d'incubation

40

-c) Rôle du pH :

La réaction enzymatique est très sensible aux variations du pH. Pour faire varier celui-ci, deux solutions tampons, le Tris et le 3, 3-diméthylglutarate, sont utilisées. Le pH optimal se situe aux

environs de

6

, 1 (Fig.

6

). A pH

6

, 7, la formation de lactosylcéra-

mide est de 20 à 33 % plus importante dans le tampon au 3, 3-dimé- thylglutarate que dans le tampon Tris. Cet effet de la nature du tampon sur la formation du glycolipide a été confirmé par trois ex­ périences réalisées avec des préparations différentes de microso- mes. Par ailleurs, l'addition de la suspension des microsomes au milieu d'incubation provoque une variation mininae du pH, inférieure à

0

,

02

unités.

d) Stimulation de la formation du lactosylcéramide par le glucosyl- céramide ;

Comme le montre la figure 7, la formation du lactosylcéra­ mide est accrue considérablement par l'addition de glucosylcéramide. A partir de la représentation graphique des valeurs (Fig. 7), il a été possible de déterminer la constante apparente de MICHAELIS qui est

égale à 3, 3 X lO"^. En l'absence du glucosylcéramide, la synthèse

m

;j

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

IN

C

O

R

P

O

R

É

S

/m

g

P

R

O

T

É

IN

e

V

.

1

5

m

i

pH

Figure 6 :

Effet de la variatipn du pH si:ir la formation du

lactosyl-céramidé (CDU) et du triglycosylcérarnide (CTH) à

partir du glucosylcéramide. exogène. Deux solutions

tampons sont utilisées pour faire varier le pH : le tampon

Tris

b

-

q

) et-le 3-3dirnéthylglutarate (•-• ,

).

m

;j

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

IN

C

O

R

P

O

R

E

S

/m

g

P

R

O

T

É

iN

E

S

/l

S

m

i

V

O

02

0.4

0.6

[GLUCOSYLCERAMiDE] (mM)

La méthode suivie pour la séparation du glucosylcéramide est identique à celle décrite pour la préparation de ce lipide à par­ tir d'une rate d'un patient atteint de la maladie de Gaucher (page22). Le dosage a été effectué en mesurant la quantité du glucose du glu­ cosylcéramide par la méthode, légèrement modifiée, de GREANEY

(

1961

).

I

La rate du rat contient entre 100 et 200_/ig de glucosylcéra­ mide par g de poids d'organe frais, La fraction microsomiale est

environ

20

fois plus pauvre en ce lipide que l'homogénat entier.

Aussi, en l'absence de glucosylcéramide exogène, la synthèse de lactosylcéramide est plus importante avec l'homogénat entier qu'a­ vec la préparation microsomiale.

e) Formation du lactosylcéramide en fonction de la durée d'incubation

La biosynthèse du lactosylcéramide est proportionnelle au temps d'incubation, pendant 15 minutes, ensuite, elle atteint très rapidement un plateau.

Dans les mêmes incubations, la quantité du triglycosylcéra-

mide formé augmente jusqu'à la fin de la seconde heure (Fig.

8

).

Inférieure à celle du lactosylcéramide pendant la première heure, la synthèse du triglycosylcéramide la dépasse après deux heures d'in­ cubation.

sphingo-m

jj

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

IN

C

O

R

P

O

R

É

s

/m

g

O Cu

glycolipides suggère que, dans le système étudié, le lactosylcéra- mide formé à partir de glucosylcéramide est, à son tour, le pré­ curseur du triglycosylcéramide.

f) Stimulation de la fonction du lactosylcéramide par l'UDP-galactose :

Les concentrations croissantes de l'UDP-galactose augmen­ tent la formation du lactosylcéramide et aussi celle du triglycosylcé­ ramide (Fig. 9). Les courbes de ce graphique ont un profil particu­ lier dû aux valeurs trop basses des premiers points. Ces résiiltats s'expliquent cependant ai-sément. En effet, les deux substrats, le glucosylcéramide exogène et le lactosylcéramide, formés durant l'in­ cubation, se trouvent en présence d'un seul donneur du galactose. Une partie de l'UDP-galactose se trouve aussi incorporée dans le lac­ tosylcéramide, et une autre dans le triglycosylcéramide. Si on ad­ ditionne les quantités de galactose incorporées dans les deux produits, on obtient alors une courbe dont l'allure est habituelle de la relation précurseur - produit (Fig. 9).

La forme particulière des courbes pourrait être due égale­ ment à l'instabilité de l'UDP-galactose. Cependant, cette hypothèse a pu être écartée car le nucléotide est parfaitement stable dans les conditions expérimentales utilisées. En effet, après une incubation standard, pratiquement toute la radio-activité ajoutée a été retrou­ vée dans la phase supérieure de Folch rattachée à l'UDP-galactose,

tam-

-46-C •

Figure 9 : Stimulation de la formation du lactosylcéramide (CDH) et du

triglycosylcéramide (CTH), à partir du glucosylcéramide, • par l'UDP-galactose. Les autres conditions d'incubation sont ■ habituelles,

O = incorporàtioh du galactose dans le CDH

• = incorporation du galactose dans le CTH

pon de phosphate de sodium O. I. M. (pH

6

,

8

), 60 g de (NH

4

) SO

4

et

2

ml de n-propanol).

g) Stimulation de la formation du lactosylcéramide par la prépa­ ration microsomiale :

Les expériences précédentes ont permis d'établir les con­ ditions d'incubation telles que tous les réactifs, à l'exception de l'enzyme, se trouvent en concentrations supramaximales. L'en­ zyme est ainsi le facteur qui limite la réaction de synthèse.

La quantité de lactosylcéramide formé dans les incubations standards devrait donc être proportionnelle à la quantité d'enzyme ajoutée. La figure 10 montre qu'il en est bien ainsi.

Stabilité du lactosylcéramide dans le milieu d'incubation :

m

;j

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

IN

C

0

R

P

0

R

E

S

/l

5

48

-Figure lO : Stimulation de la formation du lactosylcéramide (CDH)

et du triglycosylcéramide (CTH) à partir du glucosyl- • céramide, par des quantités .croissantes des microsomes utilisés comme source d'enzyme.

coucha mince, comme le lactosylcéramide. Ainsi, même après

une incubation de

60

minutes, la destruction du glycolipide est

peu importante.

III. DISCUSSION

En présence du glucosylcéramide, d'UDP-galactose mar­ qué et d'une suspension de microsomes de la rate du rat, plusieurs produits radio-actifs sont formés.

L'un d'eux, le pic B, est identifié comme le lactosylcéra­ mide. Ce pic qui est élué d'une colonne de Florisil par du chloro­ forme-méthanol : 2, 1 (v/v) contenant 5 % de 3, 3-diméthylpropanol

e

ne peut être, selon MARTENSSON, que le glucosylcéramide ou le

lactosylcéramide (mÂrTENSSON, 1966). Par sa migration lors de

la chromatographie en couche mince, le pic B est différencié du glu­ cosylcéramide et identifié comme le lactosylcéramide. La stimu­ lation de la synthèse du pic B par le glucosylcéramide, son précur­

- 50

effet, certains phospholipides sont détruits par l'hydrolyse alcaline douce, et le pic B ne l'est pas. D'autre part, on ne connaît pas de phospholipides contenant du galactose. Or, le pic B en contient sû­ rement, puisque sa radio-activité a été localisée dans une molécule de galactose.

Un second produit marqué, le pic A, est identifié comme ga- lactosyl-galactosyl-glucosylcéramide (triglycolsylcéramide). Cette identification sera étudiée et discutée dans le chapitre suivant.

Nos résultats indiquent que deux réactions peuvent se pro­ duire dans le tissu, splénique :

GLUCOSYLCERAMIDE + UDP-GALACTOSE ---- ^ LACTOSYLCERAMIDE H- UDP (1)

GLUCOSYLCERAMIDE + UDP-GALACTOSE

—}

TRIGLYCOSYLCERiV-MIDE + UDP

(Z)

In vitro, les deux réactions sont stimulées par le glucosylcéra- mide, l'UDP-galactose et dépendent de la quantité de microsomes a- joutée à l'incubation comme source d'enzyme. Elles nécessitent la présence de l'ion Mn et celle d'un détergent. Les quantités de lacto-

éga-lement été observée in vivo. Il convient cependant d'être extrême­ ment prudent en transposant in vivo des observations faites in vitro. Les conditions biophysiques des deux systèmes diffèrent fortement, en particulier par la présence in vitro d'un détergent et des concen­ trations de Mn"*"^ (15 mM), très supérieures à ce qu'elles sont in vivo. En tout cas, la stabilité du lactosylcéramide dans les incuba­ tions exclut l'éventualité que le faible rendement soit dû au clivage du produit formé par une glycosidase qui contaminerait le milieu d'incubation.

52

-CHAPITRE II.

CATALYSE DE LA SYNTHESE IN VITRO DU GALACTOSYL-

GALACTOSYL-GLUCOSYLCERAMIDE (TRIGLYCQSYLCERAMIDE)

PAR UNE GALACTOSYLTRANSFERASE DE LA RATE DU RAT.

Nous venons de montrer que deux glycolipides, le lactosyl- céramide et le triglycosylcéramide, sont synthétisés in vitro à par­ tir de glucosylcéramide et de l'UDP-galactose en présence de mi- crosomes de la rate du rat. Cependant, à cause des quantités mi­ nimes du lactosylcéramide présentes dans les essais enzymatiques précédemment utilisés, il n'a pas été possible de déterminer les conditions optimales de la synthèse du triglycosylcéramide. Celles- ci seront étudiées maintenant dans un milieu d'incubation saturé en lactosylcéramide exogène. En outre, on identifiera le produit de la

synthè se.

I. MATERIEL ET METHODE

Conditions d'incubation :

30 minutes. Leur composition, dans un volume final de 0, 5 ml, est la suivante : 0, 40 mM de lactosylcéramide, 0, 84 mM d'UDP-

galactose-U-(correspondant à environ 1. 10^ cpm ou 0, 16

JJL.C),

15 mM de MnCl

2

> 0,4 % d'isooctylphénoxypolyométhanol (Cutscum),

0

, 15 ml d'une suspension de microsomes correspondant à environ

1, 60 mg de protéines et une solution tampon 53 mM de 3, 3-dimé- thylglutarate.

Préparation du triglycosylcéramide :

Le triglycosylcéramide utilisé comme standard pour la ca­ ractérisation du produit de la réaction (pic A) a été préparé à par­ tir de reins de boeufs en suivant la méthode de Mârtensson, légè­ rement modifiée (MARTENSSON, 1966).

Quatre Kg de viscères, préalablement lavés avec du sérum physiologique, débarrassés de leurs capsules ainsi que de la grai- se et du tissu fibreux présents au niveau des bassinets, sont homo­

généisés dans

19

volumes de chloroforme-méthanol :

2

,

1

(v/v).

54

-38°C, pendant 48 heures. Le milieu de l'hydrolyse, composé d'une phase aqueuse et d'une phase chloroformique, est constamment agi­ té. En fin d'hydrolyse, le pH est ramené à la neutralité avec de l'HCl, 0. 5. N.

Les graisses non hydrolysées restent dans la phase chloro­ formique et sont précipitées par l'addition d'acétone à 4°C. Le pré­

cipité est filtré, lavé avec de l'acétone frais et finalement redissous dans du chloroforme contenant 0, 1 % de méthanol. Les substances insolubles sont écartées par centrifugation. On recueille ainsi 2,65 g de lipides composés essentiellement de 7 glycolipides : glucosylcéra- mide, galactosylcéramide, lactosylcéramide, triglycosylcéramiide, tetraglycosylcéramide (globoside), galactosylsufatide et diglycosyl- sulfatide, et de sphingomyéline. Finalement, le triglycosylcéramide est isolé par chromatographie sur colonne, selon le schéma repré­ senté dans le Tableau VII (page 55 ).

I^a technique d'incubation, l'isolement et la mesure des pro­ duits radio-actifs formés, ainsi que leur identification sont réalisés suivant les méthodes exposées dans le chapitre précédent. Les pro­ cédés suivis pour l'étude de la stabilité du triglycosylcéramide dans le milieu d'incubation, la détermination de la teneur du tissu spléni­

LIPIDES TOTAUX DU REIN ^

Colonne Acide Silicic et Célite

T

CM pur

I

CM 96, 4 Colonne de Florisil C, pur F raction contenant uniquement ^ les lipides neutres CM 2, 1 Colonne de DEAE CM 2, 1 CM 2, 1 CM 2, 1 + 5% AAG

™

2, 1 • ^ • f 5% CLLi Aucun lipide GLU. CER. Aucun

GAL. CER. lipide

GLU. CER, CM 90, 10

i

Colonne DEAE CM 2, 1 + 5% AAG Aucun lipide GAL. CER.

1

+ 5% Cl

2

Li MGS LACT. CER. CM 80, 20

i

Colonne DEAE CM

r

CM

2

, 1

2

,

1

CM 2, 1 + CM 2, 1 5% AAG + 5% ClgLi Aucun lipide Colonne d’Ac. Silicic

CM 90, 10 CM 85, 15 CM 80, 20

I

I

I

Elution fractionnée Frac conter unique les ph pholip

r

MGS DGS LACT. CER. TRIG.CER.

TETR. CER. + traces Sphin ABREVIATIONS : C M GAL. CER. = GLU. CER. = chloroforme méthanol galactosylcéramide glucosylcéramide LACT. CER. TR IG. CER. TETR. CER. MGS DGS

La composition des solvants est indiquée en volumes.

lactosylcéramide

galactosyl-galactosyl-glucosylcéramide

globoside (N-acétylgalactosylrgalactosyl-galactosyl-gluco;

galactosyisulfatide céram:

56

-II. RESULTATS

, Identification du pic A :

II

Les trois groupes de produits radio-actifs foririés dans les incubations avec le glucosylcéramide (Fig. 2) sont également pré­ sents dans celles effectuées avec le lactosylcéramide. Cependant, le pic B, qui correspond au lactosylcéramide formé à partir du glucosylcéramide endogène, est considérablement réduit (Fig. 11).

Après son extraction du Silica gel G par du chloroforme- méthanol-eau ; 65, 25, 4 (v/v/v), le pic A est élué d'une colonne de Florisil avec le chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v) saturé en eau (Tableau VIII).

TABLEAU VIII

Elution du pic A d'une colonne de Florisil

Figure 11 : Scintillogramme d'une chromatographie en couche mince de l'extrait'lipidique obtenu après incubation du glucosylcé- ramide avec l'UDP-galactose-U- ^C-(O. 2 ^C). La

. chromatographie est effectuée sur plaque de Silica Gel G dans un mélange de CHCl -CH OH-H O : (65 25, 4),

58

-Le pic A résiste à l'hydrolyse alcaline douce. En effet, après ce traitement, plus de 94 % du produit soumis à l'hydro­ lyse ont été retrouvés dans la phase chloroformique.

Après méthanolyse, hydrolyse acide et séparation des sucres par chromatographie sur papier, la radio-activité du pic A est entièrement localisée dans le galactose.

Enfin, le pic A et le triglycosylcéramide authentique mi­ grent ensemble lors de la chromatographie en couche mince dans six systèmes différents. Les six systèmes utilisés sont résumés dans le tableau IV. La figure 12 illustre les résultats obtenus dans les systèmes I, II, III et IV.

Localisation subcellulaire de l'activité enzymatique :

authentique dans les systèmes I, II, III et IV,

(Tableau IV).

-

60

-TABLEAU. IX

DISTRIBUTION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE DANS LES FRACTIONS

SUB-CELLLII.AIRES DE LA RATE DU RAT.

Les conditions d'incubation dont données dans les " méthodes ".

Les différentes fractions utilisées comme sources d'enzymes ont été

préparées à partir de quantités équivalentes du tissu splénique.

Les résultats sont la moyenne de 3 expériences.

Fraction

Incorporation du galactose dans

le triglycosylcéramide.

uumoles/mg protéines/30 min.

triglycosylcéramide à partir du lactosylcéramide et de l'UDP- galactose :

a) Présence du détergent :

La présence de Cutscum, détergent non ionique, stimule la synthèse du triglycosylcéramide (Fig. 13). Quand on remplace le Cutscum par le cholate de sodium (O, 5 %), la formation du glyco­ lipide diminue de plus de 60 %. En revanche, en présence duBrij (polyoxyéthylène oléyl éther, 0, 1 %), du Cétavlon (cétyltriméthyl- amonium bromide, 0, 5 %) et du tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan

monolaurate,

0

,

2

%), ainsi que en l'absence de tout détergent, au­

cune formation du triglycosylcéramide ne peut être décelée.

b) Rôle des ions Mn et Mg :

L'ion Mn'^'*' stimule fortement la synthèse du triglycosylcé­ ramide (Fig. 14). L'ion Mg’’"'*" stimvile également, mais dans une mesure beaucoup moindre, la formation du triglycosylcéramide, a- lors que sa présence n'affecte pas la synthèse du lactosylcéramide (Fig. 5).

c) Rôle du pH :

La réaction est très sensible aux variations de pH; elle est

triglycosyl-t

62

-i/) O

Figure 13.: Effet du détergent Cutscum sur la formation du

64

-^ N.

Figure 15 : Effet de la variation du pH sur la formation du

triglycosyl-céramide à partir du lactosyltriglycosyl-céramide. Deux solutions tam­ pons sont utilisées pour faire varier le pH : le tampon

Tris (■—«) et le 3-3 dimâlaylglucotarate (•—-•).

céramide est de 30 % plus importante dans le tampon Tris que dans le tampon au 3, 3-diméthylglutarate. Cet effet de la nature de la solution est identique à celui qui a été observé pour la for­ mation du triglycosylcéramide à partir du glucosylcéramide exo­ gène. En revanche, un effet inverse a été noté pour la synthèse du lactosylcéramide (Fig. 6).

d) Stimulation de la formation du triglycosylcéramide par le lactosylcéramide :

La synthèse du triglycosylcéramide est accrue par l'addi­ tion du lactosylcéramide exogène, son précurseur immédiat (Fig. 16). La constante apparente de Michaelis de cette réacion a pu être déterminée graphiquement à partir des valeurs représentées dans la figure 16. Elle est égale à 4 x 10“

En l'absence de lactosylcéramide exogène, seule une faible quantité de triglycosylcéramide est formée. Selon l'hypothèse la plus probable, cette synthèse a lieu à partir du lactosylcéramide endogène, présent dans la suspension microsomiale ajoutée comme source d'enzyme au milieu d'incubation.

Pour confirmer cette possibilité, le lactosylcéramide a été recherché et dosé dans la rate du rat et dans les microsomes. Les

méthodes suivies ont été exposées précédemment (page

22).

m

ju

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

iN

C

O

R

P

O

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g

P

P

s

0

T

E

!N

E

^3

0

m

i

66

-O

0.1

0.2

0.4

[LACTOSYLCERAMIDE] (mM)

Figuré 16 : Stimulation de la formation du triglycosylcéramide par des

10 à 20 ug de lactosylcéramide par g d'organe frais et que la concen­ tration du sphingolipide dans la fraction microsomiale est 5 fois moindre,

e) Formation du triglycosylcéramide en fonction de la durée d'incu­ bation ;

La synthèse du triglycosylcéramide est proportionnelle au temps d'incubation pendant au moins 30 minutes. Contrairement à celle du lactosylcéramide, la formation du triglycosylcéramide con­ tinue à augmenter jusqu'à la fin de la deuxième heure (Fig. 17). Elle se ralentit ensuite considérablement. Ainsi, entre la troisième et la fin de la dix-huitième heure, son augmentation n'est que de 15 %.

f) Stimulation de la formation du triglycosylcéramide par l'UDP- galactose :

Les concentrations croissantes du nucléotide augmentent la formation du glycolipide (Fig. 18). La stabilité de l'UDP-galactose dans le milieu d'incubation a été testée comme décrit précédemment (page 45) et aucune destruction du nucléotide n'a pu être mise en évidence.

g) Stimulation de la formation du triglycosylcéramide par la prépa­ ration microsomiale :

m

ju

M

O

L

E

S

G

A

L

A

C

T

O

S

E

IN

C

O

R

P

O

R

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g

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É

IN

E

S

00

.Figure 17': Formation du triglycosylcéramide, à partir du lactosylcéramide,

m

jjM

O

L

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0

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O

T

./

3

O

[

u

DP-GALACTOSE] (mu MOLES)

Figure 18 : Stimulation de la formation du triglycosylcéramide, à partir de

70

-comme source d'enzyme (Fig. 19). Dans ces conditions, on peut considérer l'enzyme comme le facteur limitant de la réaction de synthèse. En effet, tous les autres réactifs sont présents en quan­ tité saturante comme le démontrent les expériences précédentes. Ce point sera important dans l'étude où on tentera de démontrer que les enzymes qui catalysent l'incorporation du galactose dans le lactosylcéramide et le triglycosylcéramide diffèrent entre elles.

Stabilité du Triglycosylcéramide dans le milieu d'incubation :

BRADY et ses collaborateurs ont identifié une galactosi- dase qui clive spécifiquement le galactose terminal du galactosyl- galactosyl-glucosylcéramide (BRADY et collaborateurs, 1967). Cet enzyme pouvait contaminer la préparation microsomiale et, bien que son pH optimal soit plus acide que celui utilisé dans nos expériences, nous avons testé la stabilité du triglycosylcéramide durant les incubations. Les m.éthodes suivies sont semblables à celles utilisées précédemment pour l'étude de la stabilité du lac­ tosylcéramide (page 47). Ces expériences ont montré qu'après une incubation d'une heure dans les conditions standards, plus de 90 % du triglycosylcéramide restent intacts.

III. DISCUSSION