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Figure 25 : Variations de l'activité enzymatique qui catalyse*'la formation du lactosylcéramide par cerveau entier

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-paraison de l'activité de cette enzyme avec celle des deux autres galactosyltransférase s.

Des trois produits synthétisés dans les différentes incuba­ tions, le lactosylcéramide a été identifié précédemment (page 97)

La caractérisation de la psychosine et du ganglioside est limi­

tée à la co-chromatographie avec des standards authentiques dans 3 systèmes différents et la stimulation de la formation de ces pro­ duits par leurs précurseurs immédiats respectifs, la sphingosine

et le ganglioside Cette identification semble suffisante puis­

que les deux produits ont été analysés complètement dans les tra­ vaux effectués dans d'autres laboratoires (CLELAND et KENNEDY,

I960, et BASU, KAUFMAN et ROSEMAN, 1965).

Les galactosyltransférases qui catalysent les trois réactions sont distinctes l'une de l'autre. Les deux enzymes qui interviennent respectivement dans la formation du lactosylcéramide et du ganglio­ side GMl ont été différentiées précédemment (page 89). et la troi­ sième a une courbe d'activité au cours du développement entièrement différente des deux autres. Elle est, en outre, active en présence du Mg^^, alors que les deux premiers nécessitent celle de l'ion Mn++.

Avant d'envisager les variations de l'activité des 3 enzymes au cours du développement, nous rappellerons que les conditions d'incubation où l'enzyme est le facteur limitant sont établies à l'âge où chacune des enzymes a l'activité spécifique la plus élevée. Par conséquent, les activités enzymatiques restent proportionnelles à la

quantité des produits formés dans les expériences où sont utilisés des cerveaux d'âges différents.

L'évolution de l'activité enzymatique qui catalyse la formation du lactosylcéramide, au cours de la m.aturation du cerveau, est en fa­ veur de sa participation à la biosynthèse des gangliosides. En effet, d'une part, l'activité de cette enzyme est parallèle, au cours du déve­ loppement, à celle d'une autre galactosyltransférase qui est certaine­ ment impliquée dans la formation des gangliosides puisqu'elle catalyse

la synthèse du ganglioside majeur Gmi à partir du ganglioside

D'autre part, l'activité de cette enzyme, calculée par cerveau entier, croît depuis la naissance jusqu'à la quatrième semaine. Or, c'est aus­ si pendant cette période que s'accumulent les gangliosides dans le sys­ tème nerveux central du rat (SUZUKI, 1965, MAKER et HAUSER, 1967).

Si l'enzyme étudiée est effectivement impliquée dans la forma­ tion des gangliosides par l'intermédiaire de la formation du lactosyl­ céramide, sa présence dans les synaptosomes, les mitochondries et les microsomes indiquerait que ces trois groupes de particules subcel­ lulaires sont capables de synthétiser les gangliosides. Cette dernière hypothèse est confirmée par les observations faites, tant in vivo que in vitro, par R. CAPUTO et de ses collaborateurs (RUBIOLO, DE MAC- CIONI et CAPUTO, 1968, ARCE, MACCIONl et CAPUTO, 1966). Ainsi, l'ensemble de nos résultats, sans constituer une preuve formelle, est fortement en faveur de la participation de l'enzyme qui catalyse la for­ mation du lactosylcéramide à la synthèse des gangliosides majeurs du système nerveux central.

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-L'activité de l'enzyme qui catalyse la formation de la psycho- sine suit une courbe semblable à celle de l'accumulation des cérébro- sides dans le système nerveux central (KISHIMOTO, DAVIS et RADIN, 1965, \YELLS et DITTMER, 1967, et HAUSER, 1968). Or, BRADY (1962) a pu démontrer, in vitro, que la psychosine était un précurseur des cérébrosides qui sont les lipides les plus spécifiques et quantitati­ vement importants de la myéline (BASS et HESS, 1969). Notre obser­ vation qui met en évidence la possibilité d'une biosynthèse accrue de la psychosine pendant la myélinisation confirme le rôle que pourrait jouer le lipide dans la formation des cérébrosides, tant dans le sys­ tème nerveux central que périphérique. En effet, dans le nerf scia­ tique, la formation de la psychosine est maximale entre le 4e et le 6e jour, moment où la myélinisation de ce nerf est la plus active

(FRIEDE et SAMORAJSKI, 1968). Cependant, comme on le verraplus loin, les voies de la synthèse des cérébrosides font encore l'objet de controverses, et le rôle joué par la psychosine est discuté.

CHAPITRE VI.

ETUDE DES SPHINGOGLYCOLÏPES DES LEUCOCYTES LEUCE­

MIQUES ET NON LEUCEMIQUES.

La recherche des antigènes spécifiques des tissus néoplasiques revêt aujourd'hui une importance particulière puisqu'il est acquis que l'organisme humain est capable de s'opposer, par des méchanismes im­ munologiques, à la croissance des tumeurs malignes (KLEIN et OETT-

GEN, 1969). Les sphingoglycolipides sont présents dans les tumeurs

humaines et expérimentales (GRAY, 1965, et KAWANAMI et TSUJI,

1969). Certains d'entre eux sont responsables des propriétés antigè­

niques des cancers (RAPPORT et collaborateurs, 1959). En outre, HAKOMORI a identifié des sphingoglycolipides de structure particulière, contenant une molécule de fucose, dans les carcinomes du pancréas. (HAKOMORI, 1964).

L'étude des sphingoglycolipides dans les cellules malignes des tumeurs solides est rendue difficile par leur faible concentration et la présence, dans ces cancers, d'éléments conjonctifs intimement liés aux éléments néoplasiques.

En revanche, les leucocytes sont riches en glycolipides (MIRAS, MATZOS et LEVIS, 1966), et on peut isoler des quantités importantes de globiiles blancs à partir du sang de patients leucémiques et de sujets témoins.

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-Ce travail a été entrepris dans le but de :

a) Confirmer l'exceptionnelle richesse des leucocytes en gly­ colipides neutres, précédemment décrite, par MIRAS et ses collabo­ rateurs, dans une étude basée sur l'analyse de deux cas seulement.

b) Comparer la teneur en glycolipides des différents types de leucocytes.

c) Rechercher la capacité des leucocytes leucémiques de syn­ thétiser des sphingoglycolipides spécifiques.

I. METHODES ET MATERIEL

L'analyse des lipides neutres (cholestérol, glycérides et acides

gras), des glycolipides et des phospholipides est effectuée sur 20 pré-

par3.tions de globules blancs, réparties en quatre groupes.

Les préparations du groupe I, utilisées comme témoins non leu­ cémiques, sont isolées à partir du sang de 5 patients porteurs d'une tu­ meur solide non généralisée. Ce groupe comprend, en outre, une si­ xième préparation de leucocytes provenant de plusieurs donneurs sains.

Le groupe II se compose de 4 préparations de globules blancs provenant de patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC); le groupe III de 4 préparations de globules blancs provenant de patients

atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC); et le groupe IV de 6

et 3 lymphoblastiques. Les glycolipides sont également recherchés et dosés sur 4 échantillons de lymphocytes prélevés dans le canal tho­ racique de donneurs sains (1), 4 préparations de globules rouges et 2 de plaquettes provenant de patients non leucémiques.

Isolement des leucocytes :

Dans un premier temps, on isole du sang périphérique des fractions enrichies en globules blancs soit à l'aide d'un séparateur d'éléments figurés du sang IBM, soit en laissant le sang sédimenter dans un sac en plastic contenant une solution anticoagulante (75 ml d'acide citrique 0,8 %, 2, 2 % de citrate de sodium et 2,45 % de dex­ trose). A partir de ces fractions, on purifie les leucocytes de la ma­ nière suivante. Après l'addition de 0, 15 à 0, 20 volumes d'une solution de Plasmagel (Laboratoire Bellon, Neuilly, France), on laisse sédi­ menter les érythrocytes pendant 25 à 45 minutes, à 40 °C. On prélève ensuite le surnageant que l'on centrifuge à 800 à 1. 000 tpm pour élimi­ ner le plasma et les plaquettes. Le culot de leucocytes est alors lavé 3 fois avec du sérum physiologique. Après chaque lavage, les globules rouges, qui se déposent au fond du tube de centrifugation, sont aspirés au moyen d'une pipette Pasteur et éliminés. La préparation finale de leucocytes contient par 100 globules blancs 2 à 15 hématies et 15 à 40 plaquettes.

Dans deux cas cependant (8 et 10), la contamination par les

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-quettes fut plus importante, respectivement 220 et 240 par 100 leuco­ cytes. Les préparations d'érythrocytes, des plaquettes et des lym­ phocytes non leucémiques sont pratiquement exemptes d'autres élé­ ments figurés du sang.

Extraction des lipides :

Les lipides totaiix sont extraits d'abord avec 20 volumes de chloroforme-méthanol ; 2, 1 (v/v), pendant 12 à 16 heures, puis avec 5 volumes de chloroforme-méthanol : 1, 1 (v/v), pendant 2 heures. On réunit ensuite les deux extraits lipidiques, on ajoute du chlorofor­ me de manière à ramener les proportions du mélange chloroforme- méthanol à 2, 1 (v/v), et on obtient la partition en deux phases deFolch par l'addition de 0, 2 volume d'une solution aqueuse 0, 88 % de KCl. Les lipides de la phase inférieure sont séchés par évaporation du sol­ vant sous vide et placés sur une colonne de Florisil. L'élution frac­ tionnée des lipides est effectuée avec les solvants suivants :

a) chloroforme,

b) chloroforme-méthanol : 95, 5 (v/v), c) chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v),

d) chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v) saturé en eau.

Identification des sphingoglycolipides ;

Les sphingoglycolipides, résistants à l'hydrolyse alcaline douce, ont été identifié par :

a) La chromatographie sur couche mince effectuée dans les 6 systèmes résumés dans le tableau IV (page 28). Après la chroma­ tographie, les glycolipides sont mis en évidence par le réactif an- throne-acide sulfurique. En outre, les monohexosylcéramides sont

soumis à la chromatographie sur plaques de Silica gel G imprégnées de borate de sodium et développées dans le mélange chloroforme- méthanol-eau : 65, 25,4 (v/v/v). Ce système permet de distinguer le glucosylcéramide et le galactosylcéramide (YOUNG et KANFER,

1965).

b) L'identification des hexoses par la chromatographie sur papier (page 29) après méthanolyse acide et hydrolyse acide des sphin- goglycolipides (page 29).

c) La détermination du rapport molaire entre la sphingosine et les hexoses d'une part, et entre les divers sucres d'autre part.

Dosages :

Les protéines sont dosées par la méthode de LOWRY et ses collaborateurs (1957), les lipides neutres (acides gras, glycérides et cholestérol) par celle de ZOLNER et KIRSCH (1962), le cholestérol estérifié et libre par celle de SPERRY et WEBB (1950), la sphingosine par celle de SCHMIDT et collaborateurs (1966) et le phosphore par celle de FISKE et SHUBBAROW (1925), On calcule les concentrations des phospholipides en multipliant par 25 les résultats du phosphore.

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-modification de la méthode de GREANEY (1961) : 8 à 30jttg de glyco­

lipides sont placés dans des tubes en pyrex de 12 ml. Après l'addi­

tion de 0, 5 ml du réactif acide-orcinol (5 mg d'orcinol pour 1 ml de

H2SO4 53 %), on dépose les tubes dans l'eau bouillante pendant 15

minutes. On les refroidit ensuite dans de la glace, et on ajoute 6 ml

de chloroforme-méthanol : 1, 1 (v/v). La lecture de la coloration s'ef­ fectue, après 30 minutes, au spectophotomètre, à 440 mu, contre un blanc d'acide sulfurique.

Les dosage des sucres et la détermination du rapport molaire entre le glucose et le galactose sont réalisés par deux procédés :

Procédé I : on dose les sucres totaux par la méthode de GREA­

NEY (1961), le glucose par la glucose-oxydase (HUGGET et NIXON,

1957) et on calcule le taux de galactose par différence.

Procédé II ; on sépare les bexoses par chromatographie sur pa­

pier (page 29), on élue les sucres par la technique de SPIRO (1966), et

on dose séparément le glucose et le galactose par l'anthrone (ROE, 1955).

Réactifs :

Le glucosylcéramide standard est préparé à partir de reins de O

boeuf par la méthode de MARTENSSON (page 33, Tableau VII).

Le galactosylcéramide (cérébroside) est extrait de la substance blanche du cerveau humain. Trois corps calleux, prélevés lors d'au­

topsies, sont homogénéisés dans 10 volumes de chloroforme-méthanol : 2, 1 (v/v). L'extrait lipidique est ensuite partagé en deux phases selon la technique de FOLCH. Les lipides de la phase inférieure sont séchés

sous vide, soumis à l'hydrolyse alcaline douce et transférés sur une colonne de Florisil. Après l'élimination complète des acides gras, des glycérides et du cholestérol par le chloroforme, on élue le galactosyl- céramide par le mélange chloroforme-méthanol : 95, 5 (v/v). La pure­ té du produit est contrôlée par la chromatographie sur couche mince

et l'absence de phosphore dans cette fraction lipidique.

IL RESULTATS

Composition en leucocytes des préparations analysées :

Le tableau XXI montre la composition leucocytaire des prépara­ tions examinées. Dans trois d'entre elles, cependant, (cas 3, 5 et 18) les altérations des globules blancs survenues en cours d'isolemient ne permettent pas leur identification morphologique. Pour ces 3 patients, la formule leucocytaire indiquée est celle du sang périphérique à partir duquel les leucocytes sont isolés.

Soixante-sept à 83 % des leucocytes isolés du sang des sujets non leucémiques (groupe I) sont des polynucléaires neutrophiles (PN). Les lymphocytes et les monocytes représentent ensemble 12 à 27 % seulement.

TABLEAU XXI

FOR MULE LEUCOCYTAIRE DES PREPARATIONS ANALYSEES

Groupe N" du cas Diagnostic PN neutrophile PN basophile PN éosinophile Méta­ myélocytes “Myélocytes OZ. Pro­ myélocytes Blastic Cells Lympho­ cytes Mono-cj'tes . 1 NL 73 1 21 5 2 ^ NL 69. 5 3 18.5 9 ^ 3* NL 86 1 6 7 I 4 NL 83 1 14 2 5 ■ NL 87 1 10 2 6 PNL 68 28 4 - 7 LMC 14 6 16 44 8 6 6 n , 8 LMC 62 1 4 10 19 4 9 LMC 65 1 12 20 1 . 1 10 LMC 51 1 1 24 12 5 3 3 11 LLC 100 III 12 LLC 1 98 1 13 LLC 2 98 14 LLC 4 1 93 2 15 LMA 6 12 13 37 6 26 16 LMA 98 2 ' IV 1718* LMA 0. 5 1 0. 5 73. 5 18 4. 5 LMA 80 16 4 19 LLA 1 98 1 20 LLA 0. 5 40.5 58 1

Formule établie sur le sang périphérique. Etablie sur 200 cellules.

ABREVIATIONS : P N NL PNL LMC LLC LMA LLA polynucléaires

patients non leucémiques

pool de leucocytes provenant de sujets normaux, leucémie myéloi’de chronique

leucémie lymphoide chronique leucémie myéloblastique aigue leucémie lymphoblastique aigue

1

3

chronique (LMC, groupe II) appartiennent principalement à la lignée myéloi’de (88 à 100 %). Dans ce groupe, les blastes, les lymphocytes et les monocytes sont rares ou complètement absents.

Les préparations du groupe III (leucémies lymphoïdes chroni­ ques, LLC) sont formées presque exclusivement de petits lymphocytes.

A l'encontre des trois groupes précédents, la composition des préparations provenant des patients atteints de leucémie aiguë offre des variations individuelles importantes. Dans le cas 15, 50 % des cellu­ les sont des myélocytes et des monocytes. Les autres préparations sont formées par des blastes (37 à 98 %) et des lymphocytes (l à 58 %). Deux échantillons sont des préparations très pures de myéloblastes (cas 16) et de lymphoblastes (cas de 19).

Analyse des lipides :

Les concentrations des lipides sont exprimées en mg par g de protéines dans le tableau XXII. Les différentes fractions lipidiques sont exprimées en pour-cent des lipides totaux dans le tableau XXIII.

Les lymphocytes des patients atteints de LLC ont la plus haute teneur en lipides, et ils sont particulièrement riches en phospholipides. A l'exception du groupe I, le cholestérol est le principal composant de la fraction des lipides neutres. La plus grande partie de ce lipide se trouve sous la forme non estérifiée. Cependant les différences les plus intéressantes, à la fois qualitatives et quantitatives, concernent les sphingoglycolipides.

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