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Homogénat entier du cerveau 1

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spécifique

1 100%

Centrifugation entre 17. 500 et 105. 000 g

\

CULOT

1

Congélation, sonication et centrifugation

entre 17. 500 et 105. 000 g

1

CULOT

Traité par DOC, 0. 5% ou TRITONLXlOO, 0. 8%

centrifugation à 105. 000 g

1

SURNAGEANT

2, 5 >90%

7 à 10 82 à 85%

7 à 8 10 à 20%

1

0

7

108

-alors que le surnageant en est totalement dépourvu. Seuls le déso- xycholate (Doc, 0, 5 %) et le Triton X 100 (0, 8 %) sont capables de

solubiliser de faibles quantités de cette enzyme. Mais plus de 80 % de l'activité enzymatique sont perdus pendant la manipulation, de sorte que l'activité spécifique du surnageant, qui maintenant con­ tient l'enzyme, n'est pas augmentée par rapport à la préparation de départ (Tableau XVIII).

III. DISCUSSION

Le produit de la biosynthèse (pic B) est identifié comme lac- tosylcéramide par des critères utilisés dans l'étude de la formation du lactosylcéramide de la rate du rat. Ces critères ont été discu­ tés précédemment (page 49). En outre, son identification est con­ firmée ici par la formation, après l'incubation du glucosylcéramide marqué avec l'UDP-galactose non radio-actif, d'un produit qui a les mêmes caractéristiques que le lactosylcéramide synthétisé àpartii* du glucosylcéramide non marqué et du UDP-galactose - U-^ "^C. Les résultats de cette dernière expérience indiquent aussi que le sucre attaché à la molécule du céramide est le glucose, tandis que le galac­ tose termine la chaîne des hydrates de carbone.

Pendant que ce travail était en cours, une galactosyltransfé­ rase, qui catalyse également la formation du lactosylcéramide, a été décrite dans le cerveau de l'embryon du poulet par Basu et ses

re-marquable que l'enzyme identifié par ces auteurs est également ac­ tive en présence du Mn++ et du Mg++, alors que celle que nous avons mise en évidence n'est activequ'en présence du Mn++. L'explication de cette différence nous échs-ppe actuellement.

La caractérisation complète du pic O n'a pu être effectuée principalement à cause de l'impossibilité d'extraire le produit du Sili- ca gel après la chromatographie sur couche mince. Néanmoins, cer­ taines observations permettent d'émettre une hypothèse concernant sa nature. Le pic O n'est probablement pas le résultat d'une réaction en­ zymatique puisque la présence des grandes quantités du mélange chlo- roforme-méthanol, qui dénature les protéines, n'inhibe pas sa forma­ tion, D'ailleurs, cette formation ne dépend pas de la durée de l'incu­ bation. Dans un milieu alcalin, la substance marquée, libérée du pic O, est de l'UDP-galactose. C'est donc probablement sous cette forme que la radio-activité est incorporée dans ce produit. Comme la for­ mation du pic O exige la présence de l'homogénat du tissu cérébral et que son amplitude augmente avec l'âge de l'animal expérimental, il est logique d'admettre que l'UDP-galactose s'unit à une substance qui s'accumule dans le cerveau du rat pendant la maturation. Cette subs­ tance possède, en outre, les propriétés suivantes : elle est présente dans la phase inférieure (après la partition en deux phases de Folch), elle ne migre pas en chromatographies sur couche mince et ne peut être extraite du Silica gel G. Le protéo-lipide de Folch et Lees du système nerveux central répond à ces divers critères. Or, récem.- ment, MOKRASCH et ANDELMAN (1968) ont démontré la possibilité d'une incorporation non enzymatique de diverses substances dans ce

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-protéo-lipide. Enfin, dans les expériences où l'homogénat de cer­ veau est remplacé par ce protéo-lipide, on observe la formation d'un pic O. Ces divers arguments permettent de penser que la for­ mation du pic O peut être le résultat d'une liaison entre le UDP- galactose radio-actif et le protéo-lipide de Folch et Lees.

La galactosyltransférase qui catalyse la formation du lacto- sylcéramide dans le cerveau offre beaucoup de similitude avec l'en­ zyme précédemment décrite dans la rate. In vitro, les deux enzy­ mes sont actives dans les mêmes conditions et sont inhibées par les mêmes sphingoglycolipides. On note cependant quelques différences. Ainsi, le pH optimal est de 6, 8 pour le cerveau et de 6, 1 pour la rate. Dans le cerveau, les activités spécifiques de la fraction mitochondri­ ale et mlcrosomiale sont pratiquement égales; en revanche, dans la rate, la fraction microsomiale est de loin la plus riche en activité enzymatique. Dans les deux organes, l'enzyme est localisée dans les particules subcellulaires, et, du moins dans le cerveau, elle est extrêmement difficile à détacher de leurs membranes.

Les quatre gangliosides majeurs du système nerveux central contiennent la molécule de lactosylcéramide (Tableau II, page 8 ). C'est pourquoi, avec d'autres auteurs, nous avons émis l'hypothèse que l'enzyme qui catalyse la formation du lactosylcéramide participe à la synthèse des gangliosides. Or, ceux-ci se localisent presque exclusivement dans la substance grise. Le fait qu'une activité spéci­ fique équivalente de cette enzyme a été trouvée dans les parties du cerveau riches ou pauvres en substance grise peut sembler difficile à concilier avec cette hypothèse, même si on tient compte des

expé-riences de SUZUKI et de ses collaborateurs qui ont montré la pré­

sence de faibles quantités du ganglioside dans la myéline

(SUZUKI, PODUSLO et PODUSLO, 1968). L'étude qui suit a pour objet d'apporter des arguments expérimentaux en faveur de la par­ ticipation de l'enzyme étudié à la synthèse des gangliosides majeurs du cerveau.

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-CHAPITRE V.

COMPARAISON ENTRE L'ACTIVITE DE L'ENZYME QUI CATALYSE

LA FORMATION DU LACTOSYLCERAMIDE ET CELLE DE DEUX

autres GALACTOSYLTRANSFERASES au cours du DEVELOP­

PEMENT DU CERVEAU DU RAT.

Ce travail a pour objet de montrer que la galactosyltransférase qui catalyse la synthèse du lactosylcéramide à partir du glucosylcéra- mide et de l'UDP-galactose participe effectivement à la synthèse des gangliosides du système nerveux central.

Dans ce but, on comparera, d'une part, l'activité de cette en­ zyme avec celle de deux autres galactosyltransférases au cours du dé­ veloppement du cerveau. De ces deux enzymes, l'xine catalyse la bio­ synthèse de la psychosine à partir de la sphingosine et de l'UDP-galac­ tose et pourrait participer à la synthèse des cérébrosides, l'autre ca­

talyse la formation du ganglioside à partir du ganglioside Gj^2

de l'UDP-galactose.

D'autre part, on comparera l'activité de l'enzyme qui catalyse la formation du lactosylcéramide et l'accumulation des gangliosides

dans le cerveau du rat au cours de sa maturation.

I. METHODES

Les méthodes utilisées dans ce travail sont identiques à celles du chapitre précédent. En plus, nous avons établi des conditions op­

timales d'incubation pour la formation du ganglioside et de

lapsy-chosine.

a) Conditions d'incubation pour la synthèse du ganglioside Gjvii :

Ces expériences sont effectuées à 37°C, pendant 60 minutes. Chaque milieu d'incubation contient, dans un volume total de 0, 5 ml, 0, 15 mM du ganglioside G2vl2 (l)> une solution tampon 53 mM de 3, 3-

diméthylglutarate à pH 6, 8, - 0, 15 mM de MnCl2. 0, 4 % de détergent

Cutscum, 40>UM d'UDP-galactose-U-^'^C (O, 2 à 0, 5>iC) et 150yul d'ho- mogénat de cerveau de rat âgé d'un jour, dans 9 volumes de sucrose 0, 3 M. On arrête la réaction par l'addition de 10 ml de chloroforme- méthanol : 2, 1 (v/v). La partition en deux phases de Folch est obtenue par l'addition de 0, 2 volume de KCl 0, 88 %. Le ganglioside radio-actif

synthétisé est extrait et purifié à partir de la phase supérieure par les méthodes détaillées précédemment (page 76), et identifié par la chro­ matographie en couche mince.

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