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TABLEAU XIII

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COMPETITION ENTRE LES LIPIDES ACCEPTEURS DANS LA BIOSYNTHESE DU LACTOSYL- CERAMIDE ET DU TRIGLYCOSYLCERAMIDE.

Les conditions d'incubation sont standards.

Des préparations de microsomes sont utilisées comme source d'enzyme.

Accepteurs Concentrations Incorporation du galactose

>

H—h H—h

CDH CTH

mM ppmoles/mg protéines/15 min.

Glucosylcéramide 0. 73 97. 4 + 10. 4 (5) 47. 3 + 3. 0 (5) 1 Lactosylcéramide 0. 40 10. 6 + 5.6 (6) 139. 5 + 8. 8 (6) v£> O Glucosylcéramide - -^ C O O 118. 1 + 14. 9 (7) 117. 8+2.1 (7) 1 Lactosylcéramide 0. 40J

Les chiffres entre les parenthèses représentent le nombre d'expériences, “f" ~i“

CDH = Lactosylcéramide CTH = Triglycosylcéramide

TABLEAU XIV

FORMATION DU GANGLIOSIDE G,,, A PARTIR DU GANGLIOSIDE DE

TAY SACHS ( Gj^^2 ^ •

Les conditions expérimentales sont identiques à celles données dans les méthodes . Les résultats sont la moyenne de 4 mesures.

Accepteurs exogènes Quantité par

incubation

Incorporation du galactose dans

(1) (2) (1) (2) cdh"^ CTH

^M1

m ^imoles ;ipmoles /mg proté ines/heure

Aucun Aucun - - 2. 9 3. 8 -Glucosylcéramide Aucun 144 - 7. 8 10. 0 -Lactosylcéramide Aucun 101 - 3. 1 29. 7 -Aucun ^M2 - 37. 5 3. 2 4. 5 19 Glycosylcéramide *^M2 144 37. 5 7. 3 9. 7 18. 8 Lactosylcéramide ^M2 101 37. 5 3. 0 31. 4 19. 9 Céramide *^M2 72 37. 5 0. 5 1. 9 21. 8 CDU : lactosylcéramide CTH : triglycosylcéramide «Ml ^ monosialoganglioside

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-et d'une façon parfois élective, la biosynthèse de deux lipides.

Ces trois observations sont des indications plutôt que des preuves formelles en faveur de l'existence de deux enzymes différentes. En revanche, les deux résultats suivants établis­ sent clairement la distinction entre les deux galactosyltransfé- rases.

- Les deux enzymes résistent différemment à l'élévation de la tem.pérature.

- Il n'y a pas de compétition entre les deux substrats : le glucosylcéramide et le lactosylcéramide,envers les activités enzymatiques étudiées.

Pour la première fois, la présence d'une troisième galac­ tosyltransférase est mise en évidence dans l'homogénat de la rate du rat. Cette enzyme est active dans les mêmes conditions expé­ rimentales que les deux précédentes et catalyse la formation du

ganglioside à. partir du ganglioside l'UDP-galactose :

GER-GLU-GAL-NAcGAL + UDP-GAL —> GER-GLU-GAL-NAc GAL-GAL + UDP

Cette réaction a cependant été précédemment décrite dans le cerveau embryonnaire du poulet (EASU, KAUFMAN et ROSE-

MAN, 1965). C'est pourquoi nous nous sommes limités à une iden­

tification partielle du produit. Celle-ci repose sur les valeurs Rp, identiques pour le produit et le ganglioside GjvU authentique, et la

stimulation de la formation du produit par le ganglioside pré­

curseur immédiat du ganglioside ^Ml’ et le fait que, lors de la par­ tition en deux phases de Folch, et lors de la dialyse, le produit se comporte comme un ganglioside. Cette troisième galactosyltrans­ férase a été différenciée des deux précédentes, d'une part, par l'ab­ sence de compétition entre les substrats et, d'autre part, l'absence

de dépression de la synthèse du G2y[2 par le céramide (Tableau XIV),

un sphingolipide qui inhibe partiellement la synthèse du lactosylcé- ramide et du triglycosylcéramide (Tableau XII, page 85).

La synthèse du lactosylcéramide et du triglycosylcéramide a lieu, in vitro, en présence d'homogénats de tous les tissus testés, à l'exception du sang entier et des leucocytes. Cette observation indique que les éléments figurés du sang, présents dans les diverses préparations utilisées comme source d'enzymes, ne sont pas impli­ qués dans les synthèses observées. Cependant, dans d'autres con­ ditions expérimentales, les leucocytes sont capables d'incorporer

O

le galactose marqué dans le lactosylcéramide (KAMPINE, MARTENS- SON, YANKEE et KANFER, 1968).

1

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-CHAPITRE IV.

CATALYSE DE LA SYNTHESE IN VITRO DU LACTOSYLCERAMIDE

PAR UNE GALACTOSYLTRANSFERASE DU CERVEAU DU RAT.

Le cerveau du rat figure parmis les tissus qui contiennent l'enzyme capable de catalyser la formation du lactosylcéramide. Pratiquement tous les gangliosides contiennent la molécule de lac­ tosylcéramide. Ce lipide apparaît ainsi comme l'intermédiaire obligatoire de la synthèse des gangliosides à partir des céramides. Les gangliosides comptent parmi les constituants les plus caracté­ ristiques du cerveau. C'est pourquoi il nous a semblé intéressant de démontrer la possibilité de formation du lactosylcéramide dans le cerveau du rat.

Le premier chapitre de cette étude est consacré à l'identi­ fication des produits de synthèse, à l'établissement des conditions optimales d'incubation et à l'étude de l'activité de l'enzyme dans les diverses régions du cerveau et dans les particules subcellulaires.

I. METHODES ET MATERIEL

Conditions d'incubation :

Chaque incubation standard est effectuée pendant 20 minutes à 37°C, et le milieu d'incubation contient, dans un volume total de 0, 5 ml : 0, 36 mM de glucosylcéramide, une solution tampon 53 mM

de 3, 3-diméthylglutarate à pH 6,8, 15 mM de MnCl2) 0,4 % d'un dé­

tergent non ionique Cutscum; 40yUM d'UDP-galactose-U-1 (q, 2 à

0, 5>uC) et 150 ul d'une préparation tissulaire utilisée comme source d'enzyme.

Dans les incubations effectuées avec le glucosylcéramide marqué et 1 'UDP-galactose non radio-actif, les concentrations res­ pectives de ces deux réactifs sont lO^M (correspondant à 2xl0^cprn) et lOO/^M. La durée de ces expériences est de 45 minutes. Le glu­ cosylcéramide dont le glucose est marqué uniformément par le ^'^C a été préparé par le Docteur P. STOFFYN, utilisant une méthode dé­ crite précédemment (HILDEBRAND, STOFFYN et HAUSER, 1970).

Source d'enzyme :

La source d'enzyme est soit l'homogénat total du cerveau, soit une suspension de la substance blanche ou de la substance grise, dans 9 volumes de sucrose 0, 3 M. La substance blanche est prélevée au niveau de la paroi externe du ventricule latéral suivant la technique de

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-McIIWAIN et RODNIGHT (1962), et la substance grise au niveau du cortex frontal ou du cortex cérébelleux. Le fractionnement subcel­ lulaire du tissu cérébral est effectué essentiellement selon la mé­ thode de EICPIBERG, WHITTAKER et DAWSON (1966). Après la sédimentation des débris et des noyaux à 1. 000 g, on recueille, après une centrifugation de 60 minutes à 17. 500 g, un culot compo­ sé de synaptosomes et de mitochondries.

Pour cette expérience, on utilise des rats âgés d'un jour pour éviter la contamination de cette fraction par la myéline. En­

suite, on place le culot au-dessus de trois couches de sucrose de molarités décroissantes ; 1,2, 0,8, et 0,32 M. Après deux heures de centrifugation à 53. 000 g, les synaptosomes se concentrent à l'interphase entre les couches de sucrose 0,8 et 1,2 M, tandis que les mitochondries sédimentent au fond du tube. Les microsomes sont obtenus en centrifugeant le surnageant de la fraction précédente à 105. 000 g pendant une heure.

Après l'incubation, la partition en deux phases de Folch, le lavage des extraits lipidiques, la chromatographie en couche mince et la détermination quantitative de la ra,diû-activité sont effectués par des techniques déjà exposées dans le chapitre I.

Identification des produits radio-actifs ;

La majorité des techniques employées pour l'identification du lactosylcéramide, telles que l'élution d'une colonne de Florisil,

l'hydrolyse acide et la co-chromatographie avec le lactosylcéramide authentique, ont été décrites précédemment (page 27), En plus, nous avons cherché, dans les expériences présentes, à localiser la radio­ activité dans les deux produits obtenus, l'un après l'incubation du glucosylcéramide non marqué avec l'UDP-galactose-U-^'^C, l'autre après l'incubation du glucosylcéramide marqué avec l'UDP-galactose non radio-actif. Dans ce dernier cas, l'extraction du lactosylcéra­ mide radio-actif pur à partir des plaques de Silica gel G est rendue difficile par la présence, sur la même plaque, de quantités environ 100 fois plus importantes de son précurseur m.arqué : le glucosylcé­ ramide. Les deux glycolipides sont distants de environ 20 mm seu­ lement. Pour éliminer toute contam.ination du lactosylcéramide par le glucosylcéramide, il est nécessaire de pratiquer 3 chromatogra- phies successives du produit qui migre dans la région du lactosylcé­ ramide après l'avoir extrait chaque fois du Silica gel G par du

chloroforme-méthanol-eau : 65,25,4 (v/v/v). On obtient seulement alors un pic radio-actif unique qui correspond au lactosylcéramide. Celui-ci est soumis ensuite aux mêmes critères d'identification que le produit formé à partir du glucosylcéramide non marqué et du UDP-galactose-U

II. RESULTATS

a) Identification des produits :

radio 98 radio

-actifs formés pendant l'incubation : le pic O à l'origine et le pic B qui migre dans la région du lactosylcéramide.

Le tableau XV réunit les résultats des expériences qui per­ mettent d'identifier le pic B comme étant du lactosylcéramide.

Le pic O ne migre dans aucun des six systèmes de chroma­ tographie en couche mince résumés dans le tableau IV (page 28). En outre, il ne peut être extrait du Silica gel par aucun des six solvants utilisés dans ces systèmes. Ce comportement constitue un obstacle majeur à l'identification du pic O. Cependant, quelques caractéris­ tiques importantes de ce pic ont pu être mises en évidence. La pré­

sence de l'homogénat du cerveau est nécessaire à sa formation, et son amplitude croit avec l'âge de l'animal utilisé dans l'expérience (Fig. 22). Le pic O est présent exclusivement dans la phase inférieure

après la partition de Folch, et 3 lavages successifs de cette phase par des volumes adéquats de la phase supérieure théorique ne dimi­ nuent pas son amplitude. Cependant, si le pH de la phase supérieure est rendu alcalin (entre 9 et 11), l'amplitude du pic O diminue d'envi­ ron 50 % après chaque lavage, et on retrouve la radio-activité perdue dans la phase supérieure sous forme d'UDP-galactose. Ce dernier est identifié par la chromatographie sur papier (solvant : 100 ml de

tampon de phosphate de sodium 0, 1 M (pH 6, 8), 60 g de (NH4)S04

et 2 ml de n-propanol). La formation du pic O n'est pas inhibée par la présence de grandes quantités (10 ml) de chloroforme-méthanol :

TABLEAU XV.

IDENTIFICATION DU LACTOSYLCERAMIDE.

1. Elution d'une colonne de Florisil :

Fraction éluée par cpm % de la radioactivité

éluée. - CHCL + 5% dimethylpropanol

O 0 0 %

~ CHClg - CUgOH : 2, 1 (v/v) 838 87 % + 5% dimethylpropanol - CHClg - CHgOH : 2, 1 (v/v) 125 13% saturé en eau

2. Résistance à l'hydrolyse alcaline douce :

- Plus de 96% du produit résistent au traitement.

3. Localisation de la radioactivité:

Incubation Molécule radioactive

14

- UDP-(U- C) - galactose + glucosylcéramide Galactose (95%)

14

- UDP-galactose + (U- C) - glucosylcéramide Glucose (97. 1%)

4. Cochromatographie en couche mince avec le lactosylcéramide authentique:

Le produit et les standards migrent ensemble dans six systèmes de chromatographie en couche mince (Tableau IV).

A

m

p

lit

u

d

e

d

u

p

ic

0

iC

P

M

)

190

-Augmentation de l'amplitude du pic O en fonction de l'âge du cerveau de rat.

2, 1 (v/v), elle n'est pas proportionnelle au temps d'incubation et n'est pas influencée par la présence du glucosylcéramide exogène. Finalement, un pic radio-actif ayant toutes les caractéristiques décrites pour le pic O se forme dans les incubations où l'homogé- nat du cerveau est remplacé par le protéolipide de Folch-Lees (l).

b) Conditions optimales d'incubation pour la formation dulactosyl- céranaide :

Celles-ci sont établies pour des incubations qui contiennent du glucosylcéramide 0,36 mM et une quantité d'homogénat de cer­ veau de rat âgé d'un jour correspondant à environ 1,2 mg de proté­ ines. Dans ces conditions, la synthèse du lactosylcéramide est proportionnelle à la concentration enprotéines jusqu'à l,2mg (Fig. 23 A). Elle croît linéairement avec le temps de l'incubation pen­ dant 20 minutes. Une concentration 40>uM de UDP-galactose sature la réaction (Fig. 23 C). Le pH optimal se situe aux environs de 6,8 (Fig. 23 D). Ces résultats montrent que, dans nos conditions ex­ périmentales, l'enzyme est le facteur limitant de la synthèse du lac­ tosylcéramide. Comme en cas d'incubation avec les homogénats de la rate, la présence de l'ion Mn"^+ et du détergent Cutscum est indis­ pensable. En revanche, l'ion Mg"* + n'a aucun effet sur la réaction. La formation du lactosylcéramide est déprimée par la sphingosine, la galactosylsphingosine et le céramide.

(l) Don du Dr. M. Lees, préparé selon la méthode décrite par TENNENBAUM et FOLCH (1966).

-

102

-Figure 23 : Conditions optimales pour la formation du lactosylcéramide

à partir du glucosylcéramide en présence d'homogénat du cerveau des rats âgés d'un jour,

A : stimulation de la biosynthèse par des quantités croissantes d'homogénat du cerveau, utilisée comme source d'enzyme,

B : formation du lactosylcéramide en fonction du temps de l'incubation,

C : stimulation de la biosynthèse par l'UDP-galactose. D : Effets du pH, Deux solutions tampons sont

utilisées : 3-3 diméthylglutarate (•—*) et Tris

(o

-o).

Les autres conditions d'incubation sont données dans les méthodes.

-

103

104

-c) Localisation de l'activité enzymatique :

Dans le cerveau de rats âgés de Z5 à 30 jours, l'activité enzymatique spécifique est similaire dans les régions riches en matière grise (cortex cérébral et cérébelleux) et une substance blanche (paroi externe du ventricule latéral et tronc cérébral) (Tableau XVI).

L'enzyme est localisée principalement dans les synapto- somes, les mitochondries et les microsomes (Tableau XVII), Elle est extrêmement difficile à extraire des membranes des par­ ticules subcellulaires. Cette caractéristique est mise en évidence par l'expérience qui a pour objet de solubiliser l'enzyme afin d'ob­ tenir une préparation de plus grande activité spécifique (Ta.bleau XVIII), Dans ce but, on soumet la fraction composée de synapto-

somes, mitochondries et microsomes à la sonication, à trois con­ gélations successives à - 20° C et au choc osmotique dans l'eau distillée. Après ces traitements, utilisés soit séparément, soit en association, toute l'activité enzymatique reste dans les parti­ cules subcellulaires dont l'activité spécifique se trouve accrue par l'élimination, dans le surnageant, de protéines qui ne possèdent pas l'activité enzymatique étudiée. D'autre part, des agents chi­ miques tels que le n-butanol (3 et 6 %), le butanol (6 %), le cho- late de sodium (O, 4, 0, 8 et 1, 2 %) et le dodécyl sulfate de sodium

(O, 1, 0, 5 et 0, 8 %) inhibent l'activité enzymatique sans pouvoir la rendre soluble. En effet, quand on élimine ces agents en lavant les particules traitées avec une solution de tampon Tris à pH 6,8, on retrouve 25 à 64 % de l'activité enzymatique dans les organelles

T A B I. E A U XVI

BIOSYNTHESE DU LACTOSYLCERAMIDE DANS DIFFERENTES

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