Le matériel utilisé dans les essais est un matériel étalonné, à savoir les micropipettes et l’appareillage
Résultats :
Afin de valider le protocole PCR, plusieurs essais ont été réalisés en vérifiant chaque paramètre par rapport aux résultats. Les paramètres testés sont : les températures de PCR, la concentration MgCl2, le temps d’amplification et les paramètres d’électrophorèse.
Après la mise au point de la technique selon les paramètres précisés dans la partie matériel et méthodes, le protocole a été répété 9 fois sur les mêmes patients afin de vérifier la répétabilité de la technique.
Nous avons réussi à amplifié le gène ABCD1 et à maitriser les paramètres de la technique (figure 10).
Figure 10 : Amplification réussie du gène ABCD1 chez huit patients.
Au total dix-huit échantillons de patients ont été testés par cette méthode. Quatre patients présentaient la mutation c.1661G>A (p.Arg554His). Chez eux la mutation a été révélée par notre méthode RFLP. Les échantillons de ces patients ont fait l’objet du séquençage, qui a
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286pb confirmé l’atteinte par la même mutation. Chez le reste des patients la mutation n’a pas été détectée.
La figure 11 et la figure 12 montrent les deux bandes obtenues après digestion par l’enzyme Tsp451, ce qui confirme la présence de la mutation c.1661G>A (p.Arg554His) chez ces patients.
Figure 11 : Profil électrophorétique d’un échantillon muté après digestion enzymatique.
Figure 12 : Profil électrophorétique d’un échantillon muté après digestion enzymatique.:
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Discussion :
A la lumière des résultats obtenus, la technique développée au sein de notre laboratoire de biochimie peut être utilisée comme test de routine, et être appliquée pour la recherche de la mutation c.1661G>A (p.Arg554His) chez les patients suspects d’être atteints d’X-ALD. Elle peut être aussi systématiquement appliquée chez tous les patients appartenant à des familles ayant cette mutation chez l’un de ses membres.
Vu l’aspect rare de la maladie [11], le nombre de patients était limité, mais nous estimons qu’il est représentatif, du moment où tous les profils y sont présents. Ainsi notre série comporte des patients atteints de la maladie avec mutation connue, des patients atteints de la maladie avec mutation non connue, des patients sains et des patients suspects.
La maitrise des paramètres de l’environnement des essais est d’une grande importance, et constitue la partie la plus importante du travail. Ainsi, il faut travailler sur chaque paramètre tout seul, puis le tester avec les autres paramètres et observer son impact sur le résultat obtenu à chaque phase de l’essai. Et ce, sur le niveau microscopique tel que les concentrations des réactifs et l’étalonnage des micropipettes, sans négliger le niveau macroscopique tels que la saison par exemple qui peut affecter la vitesse de solidification de la gélose. Chaque paramètre de l’essai a son impact sur le résultat final de la révélation des bandes d’ADN.
Les résultats préliminaires de ce travail vont contribuer à mieux comprendre la maladie dans notre contexte marocain et va donner naissance à de nouvelles ébauches pour faciliter le diagnostic et la prise en charge des patients marocains.
La recherche de mutations de l’X-ALD permet la confirmation de la maladie et la détermination de la mutation chez le patient atteint et chez sa famille. Elle permet aussi d’identifier les femmes fausses négatives lors du dosage des AGTLC. C’est l’élément clé lors du conseil génétique pour repérer les cas asymptomatiques et leur permettre l’accès au traitement, qui ne peut avoir lieu que dans une fenêtre thérapeutique très étroite entre l’apparition de la première lésion à l’IRM et avant l’apparition d’aucun symptôme neurologique. Enfin, elle intervient dans la prévention de la maladie, via le diagnostic prénatal et préimplantatoire [12], [13].
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Conclusion
Nous avons réussi à mettre au point cette technique moléculaire de Recherche de la mutation c.1661G>A (p.Arg554His), au sein du laboratoire de biochimie. Ceci nous a permis de déterminer la fréquence de cette mutation au sein de notre cohorte, et serviront dans le conseil génétique et la prévention de l’X-ALD chez les familles ayant cette mutation, ce qui réduira ainsi le temps et le cout du diagnostic et offre ainsi un diagnostic précoce. Ces résultats permettront de déterminer par la suite les mutations les plus fréquentes dans notre contexte marocain. Ces paramètres pourront être adaptés pour l’étude de la fréquence des autres mutations.
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[4] J. Berger, S. Forss-Petter, et F. S. Eichler, « Pathophysiology of X-linked adrenoleukodystrophy », Biochimie, vol. 98, p. 135‑142, mars 2014.
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[10] F. Trivin et T. Le Bricon, « Nouvelles techniques d’électrophorèse : applications aux protéines et à l’ADN », Immuno-Anal. Biol. Spéc., vol. 18, no 1, p. 11‑22, févr. 2003. [11] P. Aubourg, « Adrénoleucodystrophie liée à l’X », Ann. Endocrinol., vol. 68, no 6, p.
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