1.1. Mcl-1 est une cible précoce et ubiquitaire des glycosides cardiaques
Mcl-1 est une protéine très finement régulée, de son expression à la protéine elle-même. Dans notre étude, une diminution de l’expression de Mcl-1 a été mise en évidence après traitement à l’UNBS1450 à 20 nM, à partir de 6 h pour la lignée U937 et 12 h pour la lignée Jurkat (Figure 14). Nos résultats concernant les cellules U937 sont en accord avec ceux présentés par Juncker et al. (127), montrant un effet cytotoxique de l’UNBS1450 à des concentrations de l’ordre du nanomolaire pour les lignées U937 et Jurkat, ainsi qu’une diminution précoce de Mcl-1 dans la lignée U937. Cependant, dans cette précédente étude, ces effets précoces sur Mcl-1 n’avaient pas été démontrés dans la lignée Jurkat. D’après la littérature, l’ouabaïne (186) tout comme la digitoxine (185), permettent, quant à elles, de diminuer l’expression de Mcl-1 à des concentrations de l’ordre du nanomolaire dans des lignées du cancer du poumon. Ces premiers résultats montrent que l’effet l’UNBS1450 cible de façon précoce et préférentielle Mcl-1 et suggèrent que cette propriété soit commune à tous les glycosides cardiaques. Partant de cette hypothèse, nous avons étudié l’effet de l’UNBS1450 sur différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines, hétérogènes par leur origine et par leur expression basale des trois protéines anti-apoptotiques testées (Mcl-1, Bcl-2 et Bcl-xL) (Figure 15). Pour des traitements de ces lignées cellulaires à des concentrations correspondantes à leur IC50 (Tableau 9), la protéine Mcl-1 est affectée alors que Bcl-2 ne l’est pas ou peu. La modulation de Bcl-xL est, quant à elle, liée au contexte cellulaire. Cet effet sur l’expression de la protéine Mcl-1, nous amène à évaluer si un tel effet est induit par d’autres cardénolides, et plus généralement par les glycosides cardiaques. A ce jour, peu de publications mettent en évidence l’effet des glycosides cardiaques sur la modulation des protéines de la famille Bcl-2. Dans le cas de Mcl-1, l’ouabaïne et la digitoxine diminuent son expression dans les cancers du poumon (185, 186), tandis que les bufadienolides, la bufaline, la bufotaline et la gamabufotaline diminuent son expression dans les cancers du sein et les adénocarcinomes (142, 188). Ces résultats suggèrent que Mcl-1 est une protéine jouant un rôle central dans les effets induits par les GCs. L’étude de l’apoptose et de l’expression des protéines de la famille Bcl-2 lors de traitements avec trois autres cardénolides (ouabaïne, digoxine et digitoxine) et deux bufadiénolides (cinobufagine et proscillaridine A) a mis en évidence que dans tous les cas, ces composés induisent l’apoptose à des concentrations de
l’ordre du nanomolaire et qu’ils diminuent fortement l’expression de Mcl-1, de Bcl-xL (mais de façon moindre pour les bufadiénolides), et malgré une forte induction de l’apoptose, Bcl-2 n’est pas ou peu diminuée (Figure 17).
Ces premiers résultats nous permettent de montrer que Mcl-1 est une cible ubiquitaire des glycosides cardiaques dans la majorité des lignées cellulaires cancéreuses à des concentrations de l’ordre du nanomolaire. L’UNBS1450 et la proscillaridine A apparaissent comme les composés les plus actifs.
1.2. L’UNBS1450 diminue l’expression de la protéine Mcl-1 via un mécanisme impliquant une diminution de la stabilité protéique et le protéasome
Dans notre étude, l’UNBS1450 et l’ouabaïne ont été utilisés comme substances représentatives des GCs afin de déterminer les mécanismes par lesquels les glycosides cardiaques peuvent réguler l’induction de l’apoptose ainsi que la dégradation de Mcl-1.
L’étude de l’expression de l’ARNm de Mcl-1 après traitement n’a pas montré d’effet significatif de l’UNBS1450 sur la transcription du gène Mcl-1. Ces résultats ont été confirmés par des analyses par puce à ADN dans la lignée U937 (Figure 19), qui ont montré que l’UNBS1450 n’a pas d’effet sur l’ARNm des protéines Bcl-2, Bcl-xL et Mcl-1, et plus généralement que ce composé n’a pas d’effet majeur sur le transcriptome. Des études par PCR ont permis de confirmer que l’UNBS1450 n’a pas d’effets sur l’ARNm de la protéine Mcl-1 (Figure 20).
En s’appuyant sur la littérature, nous pouvons noter que Mcl-1 est souvent, dans le cas des glycosides cardiaques, dégradée par un système dépendant du protéasome. Cette dégradation peut être initiée par la présence de dérivés réactifs de l’oxygène, dans le cas d’un traitement à l’ouabaïne (186), ou dépendant de l’activation de la GSK-3β pour le traitement avec la digitoxine (185). Cependant, le protéasome n’est pas toujours impliqué. En effet, nos résultats sont contraires aux observations faites avec certains bufadiénolides, qui montrent que l’inhibition de la voie STAT3 peut être aussi responsable de la diminution de Mcl-1 (142).
Pour la suite de nos études, nous nous sommes focalisés sur la régulation de la protéine Mcl-1. Les précédentes observations tendent à montrer que l’UNBS1450 régule Mcl-1 au
niveau de la protéine. Les expériences réalisées en présence de l’inhibiteur de la synthèse protéique (CHX) suggèrent que la stabilité de Mcl-1 est affectée par l’UNBS1450. En effet, la comparaison de la stabilité de la protéine Mcl-1 lors d’un traitement au CHX avec ou sans co-traitement avec l’UNBS1450 montre une différence significative de stabilité (Figure 21). Cette observation doit cependant être validée et le mécanisme par lequel cette protéine est dégradée doit être déterminé. Par conséquent, l’expression de Mcl-1 a été étudiée après un co-traitement avec l’UNBS1450 et un inhibiteur du protéasome (MG132). Les résultats ont montré que l’inhibition du protéasome prévient la diminution de la protéine Mcl-1 induite par le traitement avec l’UNBS1450. Ces résultats conduisent à conclure que l’UNBS1450 induit une dégradation de la protéine Mcl-1 via le protéasome (Figure 22).
Les protéines de la famille Bcl-2 étudiées peuvent être des substrats des caspases (93, 212, 213). Afin de vérifier l’implication des caspases dans la dégradation précoce de Mcl-1, nous avons utilisé un inhibiteur ubiquitaire de caspases en co-traitement avec l’UNBS1450. Nos observations montrent que ni Mcl-1, ni Bcl-xL ne sont clivées par les caspases, lorsque nous inhibons l’activité des caspases. Les caspases ne sont pas impliquées dans la dégradation précoce de Mcl-1 et Bcl-xL. Comme attendu, une réversion complète de l’apoptose est observée puisque l’UNBS1450 induit une mort de type apoptotique dans les cellules U937. Ces données sont cohérentes avec les résultats observés précédemment dans notre laboratoire sur les lignées hématopoïétiques où nous avions montré l’induction de l’apoptose dans cette lignée (127).
La dégradation de Mcl-1 par le protéasome peut être initiée par différents facteurs. La séquestration de Mcl-1 peut se faire par la protéine NOXA, la protéine BH3 la plus impliquée dans la dégradation de Mcl-1 et exprimée en cas de stress (214) . Des phosphorylations de Mcl-1 peuvent également conduire à sa dégradation (88). Ces événements conduisent à une ubiquitination de Mcl-1 par les ligases Trim7, SCFβ-TrCP, E3 SCFFBW7
ou Mule, ou encore en cas de mitose prolongée par APC/CCdc20 (25, 88).
Nous avons étudié l’implication et l’expression de NOXA lors de traitements avec l’UNBS1450 (Figure 23). Sur la base d’une analyse cinétique, nous avons montré que NOXA est induite à partir de 12 h de traitement alors que l’expression de l’ARNm est induite à partir de 10 h. Cependant, dans notre cas, son expression ne débute qu’après la dégradation précoce de Mcl-1. Ces résultats signifient que le rôle de NOXA n’est pas responsable de la dégradation précoce de Mcl-1, mais pourrait amplifier les phénomènes apoptotiques. Selon la
littérature, la protéine Mcl-1 pourrait être dégradée suite à l’activation de phosphorylations, permettant à Mcl-1 d’être ubiquitinée puis dégradée par le protéasome.
Dans cette partie de notre étude, nous avons démontré que l’UNBS1450 induit une dégradation précoce de Mcl-1, au niveau de la protéine et non pas de sa transcription. Ce mécanisme implique le protéasome, mais n’est lié ni à l’activation des caspases, ni à l’expression de NOXA.
1.3. La diminution de Mcl-1 régule les effets induits par l’UNBS1450 sur l’apoptose
L’UNBS1450 ainsi que les cinq autres glycosides cardiaques étudiés induisent une dégradation précoce de Mcl-1. De manière à déterminer si Mcl-1 joue un rôle décisif dans l’induction de l’apoptose par cette famille de composés, nous avons réalisé une analyse fonctionnelle en modifiant l’expression de Mcl-1, par transfection de deux plasmides permettant de surexprimer Mcl-1: l’un exprimant Mcl-1 de type sauvage, et l’autre muté au niveau des sites d’ubiquitinations de Mcl-1 empêchant ainsi l’ubiquitination de la protéine et sa dégradation par le protéasome.
Comme les cellules U937 ne sont pas un bon système pour la transfection et que la lignée Jurkat ne maintient pas la surexpression de Mcl-1 (Figure 25), cette expérience a été réalisée sur la lignée SH-SY5Y, qui exprime Mcl-1 de façon similaire aux lignées U937 et Jurkat (Figure 15) et qui réagit de la même façon au traitement à l’UNBS1450 (Etudes réalisées dans notre laboratoire).
Ces expériences montrent qu’une surexpression de Mcl-1 WT n’est pas nécessaire pour prévenir la mort cellulaire dans la lignée SH-SY5Y. Ces observations ont été démontrées pour l’ouabaïne qui est capable de diminuer Mcl-1 même quand cette protéine est surexprimée (186). Ces résultats valident le fait que Mcl-1 est une cible préférentielle des glycosides cardiaques, notamment des cardénolides, car sa dégradation se fait de façon indépendante de son expression basale.
Cependant, lorsque les cellules sont transfectées avec la protéine Mcl-1 mutée sur ses zones d’ubiquitination, la dégradation de Mcl-1 par la protéasome ne peut se produire, ce qui
entraine une protection des cellules contre l’induction de l’apoptose comme le montre l’analyse de la morphologie nucléaire et l’observation de la réduction du clivage des pro-caspases-3 et -7 dans la lignée SH-SY5Y (Figure 26). Ces résultats sont comparables à ceux de la littérature, montrant que l’inhibition de la dégradation de Mcl-1 par le protéasome, en utilisant le bortezomide, protège les cellules contre la mort par apoptose induite par le Taxol (215). Même si Mcl-1 est sensible au traitement, cette protéine joue donc un rôle majeur dans l’initiation de l’apoptose.
Ces résultats confirment l’importance de Mcl-1 dans l’induction de l’apoptose par l’UNBS1450, notamment dans les formes résistantes des cancers, comme déjà démontré dans la littérature (216). La protection de Mcl-1 contre sa dégradation par le protéasome a été confirmée par l’utilisation de MG132 pour inhiber la dégradation de Mcl-1 lors d’un traitement avec l’UNBS1450 dans la lignée SH-SY5Y. Nous observons que la présence de Mcl-1, suite au traitement au MG132, permet de protéger les cellules SH-SY5Y de la mort cellulaire comme observé précédemment après expression du plasmide Mcl-1 KR (Figure 27).
Nous avons montré que Mcl-1 joue un rôle central dans l’induction de l’apoptose par l’UNBS1450 puisqu’une inhibition de son ubiquitination et de sa dégradation par le protéasome protège les cellules SH-SY5Y de la mort par apoptose induite par l’UNBS1450.
1.4. Les glycosides cardiaques sensibilisent les cellules à l’induction de l’apoptose par TRAIL
Les glycosides cardiaques apparaissent comme une alternative intéressante pour sensibiliser les cancers résistants aux traitements conventionnels. Tel TRAIL, connu comme étant un inducteur physiologique de l’apoptose extrinsèque. En effet, il a été démontré qu’un traitement à l’ouabaïne permettait de diminuer l’expression de Mcl-1 et qu’un co-traitement associant l’ouabaïne et TRAIL engendre une induction accrue de l’apoptose. L’ouabaïne permet effectivement de sensibiliser les cellules au traitement par TRAIL dans les lignées cellulaires cancéreuses du poumon (186), tout comme la digitoxine dans des lignées de glioblastome (203) et les bufadienolides dans les cancers du sein via l’inhibition de STAT3/Mcl-1 (142) et dans les adénocarcinomes via Bid et STAT1 (188).
Les études préliminaires de co-traitement avec TRAIL et l’UNBS1450 ou l’ouabaïne menées au cours de notre étude ont montré une sensibilisation au traitement avec TRAIL lorsque l’UNBS1450 et l’ouabaïne sont utilisés à des concentrations non apoptotiques, respectivement de 10 nM et 50 nM tels que nous l’observons dans la littérature (Figure 28). Il reste cependant à déterminer dans notre cas si la dégradation de Mcl-1 joue un rôle déterminant dans l’effet synergique observé, comme pour d’autres GCs.