Liens entre les glycosides cardiaques et la famille Bcl-2

Une étude récente a démontré que la digitoxine et un de ses dérivés avaient la particularité d’induire la dégradation de Mcl-1 par la voie du protéasome après une phosphorylation de la protéine par la GSK-3-β et induire l’anoïkis, encore une fois la mort cellulaire est induite sans effet sur l’expression de la protéine Bcl-2 (185). L’importance de Mcl-1 dans la mort cellulaire est encore démontrée dans deux autres publications, qui mettent en lumière le rôle de cette protéine dans la mort cellulaire, d’une part en montrant que l’ouabaïne et la bufadiénolide sont capables de diminuer l’expression de cette protéine et plus modestement diminuer l’expression de Bcl-xL, mais pas seulement, ils démontrent en plus que ces composés de part leur effet sur Mcl-1 permettent de sensibiliser les cellules à l’induction de la mort cellulaire par TRAIL (142, 186). L’ouabaïne diminue l’expression Bcl-xL a des effets sur l’expression de Bcl-2 à de fortes concentrations (micromolaire) dans les neuroblastomes et induit la mort cellulaire (187). Une étude sur les bufadiénolides, plus particulièrement la bufotaline, utilisée en prétraitement, a montré un pouvoir de sensibilisation pour TRAIL et le TNF-α en induisant la mort cellulaire et en montrant une forte diminution de Mcl-1, Bcl-xL et d’autres protéines de survie cellulaire (Bcl-2 n’a pas été étudiée) (188).

L’ensemble des publications, étudiant les effets des glycosides cardiaques, montre que ces composés diminuent l’expression de Mcl-1 avec des effets plus modestes sur l’expression de Bcl-xL et Bcl-2. De plus, il semblerait que plus particulièrement Mcl-1 soit une protéine centrale dans les effets de sensibilisation, notamment pour TRAIL.

Mcl-1 est une protéine responsable de la résistance des cellules cancéreuses. Nous avons montré que de nombreuses publications scientifiques étudiant les effets des glycosides cardiaques sur l’expression des protéines de la famille Bcl-2 ont observé un fort effet de ces composés sur l’expression de Mcl-1 en plus de leur pouvoir sensibilisateur lors de co-traitement avec d’autres composés anti-cancéreux. Il sera intéressant d’étudier les actions des glycosides cardiaques, plus précisément, sur la régulation de Mcl-1, afin de mieux connaître leurs effets anti-cancéreux.

OBJECTIFS

Les glycosides cardiaques sont des molécules utilisées couramment en clinique dans le cadre du traitement de pathologies cardiaques. Leur mécanisme d’action consiste à se lier et à inhiber la pompe sodium-potassium ou Na⁺-K⁺-ATPase. Récemment, un potentiel anti-cancéreux a été attribué à cette classe de médicaments. Leurs effets sur la prolifération et la viabilité de différentes cellules cancéreuses ont été mis en évidence dans de nombreuses études in vitro et in vivo. La fixation et l’inhibition de la pompe Na⁺-K⁺-ATPase ont été proposées comme étant les deux événements les plus précoces expliquant les activités biologiques engendrées. Cette hypothèse est confortée par le fait que ces pompes sont souvent surexprimées par différents types de cancers. Cependant bien que les glycosides cardiaques soient connus pour cibler la pompe Na⁺-K⁺-ATPase et que leur utilisation en clinique pour le traitement des maladies cardiaques soit validée, leur utilisation en cancérologie reste encore floue. En effet, les effets pléiotropiques de ces composés ont tendance à rendre difficile l’identification de leur première cible et par conséquent la compréhension de leur effets anti-cancéreux.

Des études antérieures menées au laboratoire ont mis en évidence l’effet cytostatique et cytotoxique de l’UNBS1450, un dérivé hémisynthétique de la 2’’-oxovoruscharine extraite de la plante Calotropis procera qui induit la mort des cellules leucémiques par apoptose. Ces travaux ont permis de mettre en évidence que Mcl-1 est une cible précoce dans la lignée leucémique U937. Cette propriété est commune à d’autres cardénolides telles l’ouabaïne (186), la digoxine (185, 189) et les bufadienolides (142).

Notre hypothèse de travail est que la protéine Mcl-1 est une cible précoce et ubiquitaire des glycosides cardiaques dans différentes types de cancers (i.e. leucémies, poumon, prostate, sein, neuroblastome) et que la modulation de cette protéine peut-être un indicateur du potentiel anti-cancéreux de cette classe de composés.

Afin de valider notre hypothèse, nous utiliserons différentes stratégies pour étudier le rôle de Mcl-1 dans l’effet anti-cancéreux des glycosides cardiaques.

1. Tout d’abord nous analyserons les effets de l’UNBS1450 sur l’expression des protéines de la famille Bcl-2 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses en utilisant différentes approches.

a. Dans un premier temps, nous analyserons la cinétique d’expression des protéines de la famille Bcl-2 par Western blot dans les lignées U937 et Jurkat afin de montrer que Mcl-1 est une cible précoce de l’UNBS1450. Ensuite, de manière à vérifier si cet effet de l’UNBS1450 sur Mcl-1 est spécifique aux lignées étudiées, nous étudierons l’expression de ces protéines de survie dans différentes lignées cellulaires en issues de plusieurs types de cancers. Finalement, afin de vérifier si l’effet induit par l’UNBS1450 sur les protéines de la famille Bcl-2 ainsi que sur l’apoptose peut être généralisé à d’autres glycosides cardiaques, nous évaluerons l’effet des cardénolides et des bufadiénolides sur la lignée hématopoïétique U937.

b. Nous analyserons ensuite le niveau de régulation de l’expression de Mcl-1 par l’UNBS1450, notamment en étudiant l’effet de ce cardénolide sur l’ARN messager et la stabilité protéique de Mcl-1, ainsi qu’en évaluant les effets de divers inhibiteurs de la régulation protéique, tels que le cycloheximide et le MG132 sur l’expression de Mcl-1, en co-traitement avec l’UNBS1450. Nous étudierons également l’implication des caspases et de NOXA dans cette régulation.

c. Finalement, nous tenterons d’élucider l’implication de Mcl-1 dans les effets observés sur la mort cellulaire. Cette étude sera réalisée sur la lignée de neuroblastome SH-SY5Y, connue pour être un bon modèle pour les transfections et dans laquelle l’UNBS1450 induit les mêmes modulations de l’apoptose et de Mcl-1, que celles observées dans la lignée U937. Nous analyserons l’effet de l’UNBS1450 sur ces lignées transfectées avec un plasmide de surexpression de Mcl-1 ainsi qu’un plasmide de Mcl-1 mutée (Mcl-1 KR) non-ubiquitinable ; nous vérifierons ensuite l’habilité d’un inhibiteur du protéasome à protéger ces cellules de la mort cellulaire par apoptose induite par l’UNBS1450.

2. Une seconde partie de ce travail sera consacrée à l’étude des voies de signalisation impliquées en amont des effets induits sur l’apoptose et sur Mcl-1 par les glycosides cardiaques dans la lignée U937.

a. Nous déterminerons si les effets anti-cancéreux observés sont liés aux mécanismes ioniques ou non-ioniques de la pompe Na⁺/K⁺-ATPase. Nous étudierons d’une part, les flux de calcium lors de traitements avec l’UNBS1450, ainsi que les effets de chélateurs de calcium sur l’apoptose et la réduction de Mcl-1 induite par l’UNBS1450.

b. D’autre part, nous définirons l’implication de kinases dans l’activité du signalosome en aval de la pompe Na⁺/K⁺-ATPase, en utilisant des inhibiteurs spécifiques de ces kinases et en observant leurs effets sur l’apoptose et la réduction de l’expression de Mcl-1 induite par l’UNBS1450.

c. Finalement, nous étudierons les effets de dépléteurs du cholestérol membranaire tels que, le méthyl-β-cyclodextrine, afin de savoir si les effets observés sont liés ou non à des interactions de la pompe Na⁺/K⁺-ATPase avec d’autres protéines de signalisation (i.e. Src).

3. Dans une dernière partie de cette thèse, nous proposons de généraliser les effets de l’UNBS1450 également sur les cellules du cancer du sein puisque les glycosides cardiaques sont connus pour leur potentiel anti-cancéreux dans les cancers du sein (125). Nous étudierons l’action de l’UNBS1450 sur le cycle cellulaire ainsi que ses effets cytotoxiques sur les lignées cancéreuses mammaires MCF-7 et MDA-MB-231.

En résumé, ce projet vise à identifier la cible cellulaire des glycosides cardiaques et de comprendre les voies de signalisation intracellulaires activées, ainsi que le rôle de Mcl-1 dans l’apoptose induite par ces composés.

MATERIELS ET METHODES