La dégradation de Mcl-1 est précocement et ubiquitairement induite par l’UNBS1450 dans

L’UNBS1450 a montré un pouvoir apoptotique sur les lignées cellulaires leucémiques. Notre but consiste à savoir à quel moment l’UNBS1450 induit la dégradation des protéines de la famille Bcl-2. Ainsi le niveau d’expression des protéines anti-apoptotiques, Mcl-1, Bcl-xL et Bcl-2, a été analysées par Western Blot après 2, 4, 6, 8, 10, 12 et 24 h de traitement avec 20 nM d’UNBS1450 dans les cellules U937 (Figure 14A) et Jurkat (Figure 14B). A partir de 6 h de traitement, sur des cellules U937, les résultats montrent une forte diminution de l’expression de Mcl-1, suivie par une baisse plus modérée de Bcl-xL à partir de 8 h. En revanche, Bcl-2 ne diminue pas significativement dans la lignée U937. La caspase-3 est clivée dans cette même lignée à partir de 12 h. Ces résultats corrèlent avec les travaux publiés par Junker et al. (127). Une cinétique semblable, mais plus tardive est observée après traitement des cellules Jurkat (Mcl-1 diminue après 12 h, et au-delà de 24 h pour Bcl-xL et pour induire le clivage de la caspase-3). Cette première approche montre que l’UNBS1450 cible de façon précoce Mcl-1 dans les deux lignées cancéreuses hématopoïétiques. Cet effet de l’UNBS1450 sera vérifié dans d’autres lignées cellulaires, en suspension et adhérentes.

La prochaine étape a consisté à déterminer si Mcl-1 est une cible ubiquitaire. Nous avons étendu notre analyse à d’autres lignées cancéreuses humaines, hétérogènes de par leur origine (différents types de cancers) et leur niveau d’expression des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Les lignées hématopoïétiques expriment pour la plupart Mcl-1 et Bcl-xL, sauf la lignée U937 qui exprime de façon plus forte Bcl-2 alors que cette même protéine est peu exprimée dans la lignée K562. Les lignées cancéreuses du poumon ou de la prostate, quant à elles, expriment fortement Bcl-xL alors que dans les lignées de neuroblastome, Mcl-1 est la protéine la plus fortement exprimée parmi les trois protéines étudiées. Les lignées de cancer du sein, MCF-7 et MDA-MB-231 expriment faiblement Mcl-1 et Bcl-2, et seule la lignée MDA-MB-231 exprime fortement Bcl-xL (Figure 15).

A

B

Figure 14 : Mcl-1 est une cible précoce de l’UNBS1450 dans les lignées cancéreuses hématopoïétiques U937 et Jurkat

Les cellules U937 (A) et Jurkat (B) ont été ensemencées à 300 000/ml et exposées à 20 nM d’UNBS1450. Les expressions de Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL et le clivage de la pro-caspase-3, sont étudiées par Western Blot aux temps indiqués. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes (panel haut). L’expression de ces protéines anti-apoptotiques est quantifiée par rapport à l‘actine-β. Les graphiques représentent l’activité des caspases-3 et -7 pour les même temps de traitement avec l’UNBS1450, que ceux analysés par Western blot, dans les lignées Jurkat et U937. Cette activité est définie par le kit Caspase-Glo® 3/7 Assay et normalisée au temps 0. Les résultats représentent la moyenne +/- ES (erreur standard) (panel bas). ** p : < 0,01 ; *** : p < 0,001 par ANOVA 1 – Sidak, comparé au contrôle. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

Figure 15 : Expression basale des principales protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 dans différentes lignées cancéreuses

Les cellules ont été ensemencées et récupérées en phase exponentielle. Les expressions de Mcl-1, Bcl-2 et Bcl-xL, sont étudiées par Western Blot. L’expression de ces protéines anti-apoptotiques est quantifiée par rapport à l’Actine-β. L’expression de ces protéines dans la lignée U937 est utilisée comme référence. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

Afin de connaître la sensibilité de ces différentes lignées cellulaires face à l’UNBS1450, les effets de l’UNBS1450 sur le métabolisme ont été déterminés par l’utilisation du CellTiter-Glo®. L’UNBS1450 est actif dans chaque lignée cellulaire à des concentrations de l’ordre du nanomolaire après 24 h de traitements. Parmi ces lignées, les plus sensibles sont la lignée de neuroblastome SH-SY5Y ainsi que les lignées hématopoïétiques Jurkat et U937 (Tableau 9).

Le traitement à l’UNBS1450, avec des concentrations correspondantes aux IC50, dans toutes les lignées étudiées, montre que ce composé diminue l’expression de Mcl-1 quelque soit la lignée étudiée. Concernant xL, sa diminution est propre au contexte cellulaire. Bcl-2 n’est pas ou peu touchée par le traitement (Figure 16). Nous pouvons remarquer que les cellules qui expriment Mcl-1 sont plus sensibles si elles ne surexpriment pas Bcl-xL.

1.1.2. Mcl-1 est une cible ubiquitaire des glycosides cardiaques

Afin de savoir si les effets de l’UNBS1450 sont généralisables à d’autres glycosides cardiaques, deux bufadienolides (proscillaridine A et cinobufagine) ainsi que trois autres cardénolides (ouabaïne, digoxine et digitoxine) ont été testés. Dans un premier temps, nous avons testé des gammes de concentrations de 10 à 200 nM afin d’étudier l’induction de l’apoptose par morphologie nucléaire. Tous les composés étudiés induisent l’apoptose à des concentrations de l’ordre du nanomolaire après 24 h de traitement dans les cellules U937, mais avec des sensibilités différentes. En effet, pour une gamme de concentration identique, les cardénolides telles la digoxine induisent l’apoptose à hauteur de 19,67 +/- 2,49%, la digitoxine 47,00 +/- 20,05% et l’ouabaïne 32,00 +/-11,04% à 75 nM, ainsi que les bufadiénolides : cinobufagin 20,33 +/- 1,25% à 75 nM. La proscillaridine A, plus active, induit l’apoptose à hauteur de 27,67 +/- 8,18% à 10 nM.

En parallèle de l’analyse de l’apoptose, l’étude de l’expression des trois protéines anti-apoptotiques (Mcl-1, Bcl-2 et Bcl-xL) par Western blot a permis de mettre en évidence que Mcl-1 diminue à des concentrations plus faibles que Bcl-xL, tout comme avec l’UNBS1450 et l’ouabaïne. En effet, lorsque l’apoptose est induite, une diminution de Mcl-1 est observée. Par contre, dans tous les cas, Bcl-2 n’est que peu ou pas touchée. Lors du traitement avec les bufadiénolides, notamment avec la proscillaridine A, nous pouvons observer que Bcl-xL est peu touchée par le traitement malgré une très forte diminution de Mcl-1 et une forte induction de l’apoptose (Figure 17).

Tableau 9 : IC50 de l’UNBS1450 après 24 h de traitement dans différentes lignées cellulaires cancéreuses

Différentes lignées en phase exponentielle de croissance ont été traitées avec différentes concentrations d’UNBS1450. L’effet de cette substance sur l’activité métabolique des cellules a été analysé par CellTiter-Glo® et les IC50 correspondant à chaque lignée ont été

déterminées. Les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes +/- ES (erreur standard).

Lignée cellulaire IC50 24h (nM) Origine U937 17,8 ±1,0 Sang Raji 40,2 ±3,7 K562 32,7 ±3,1 Jurkat 15,6 ±0,7 PC3 51,0 ±17,0 Prostate DU145 21,0 ±3,0 A549 32,0 ±3,0 Poumon SH-SY5Y 28,4 ±0,4 Système nerveux S-K-NAS 48,7 ±4,9 BE2-M17 25,0 ±2,0 MDA-MB-231 > 100 Sein MCF7 > 100

Figure 16 : Effet de l’UNBS1450 sur l’expression de protéines anti-apoptotiques

Les cellules ont été ensemencées et récupérées en phase exponentielle. Les expressions de Mcl-1, Bcl-2 et Bcl-xL, sont étudiées par Western Blot. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Ctrl : contrôle (cellules non traitées), UNBS : UNBS1450 (cellules traitées à l’UNBS1450 à des concentrations correspondantes aux IC50, après 24 h).

Figure 17 : Mcl-1 est une cible ubiquitaire des glycosides cardiaques

Les cellules U937, ensemencées à 300 000/ml, ont été exposées à différentes concentrations de trois cardénolides (A) et deux bufadienolides (B). L’induction de l’apoptose a été étudiée par suivie de la morphologie nucléaire par microscopie et de l’expression de trois protéines anti-apoptotiques (Mcl-1, Bcl-2 et Bcl-xL) par Western blot. Les résultats représentent la moyenne +/- ES (erreur standard) de trois expériences indépendantes. * : p < 0,05 ; ** p : < 0,01 ; *** : p < 0,001 par ANOVA 1 - Sidak, comparé au contrôle.

1.1.3. Mcl-1 est la première protéine anti-apoptotique affectée par les glycosides