Les GCs ont la particularité de se fixer à la pompe NKA pour induire l’activation de deux voies principales. La première est la voie ionique, induisant indirectement une modification du calcium intracellulaire. La seconde, appelée la voie non-ionique, est, quant à elle, liée au signalosome via l’activation ou la modulation de différentes kinases telle que Src (217).
2.1. Evidence de l’absence d’implication de la voie ionique dans les effets induits par l’UNBS1450
De manière à déterminer laquelle de ces deux voies est impliquée dans les effets induits par l’UNBS1450, notre étude a tout d’abord consisté à déterminer l’implication du calcium intracellulaire lors d’un traitement avec l’UNBS1450. Les résultats n’ont pas mis en évidence la mobilisation du calcium par les cellules traitées à l’UNBS1450. La chélation du calcium intra- ou extracellulaire par l’utilisation de chélateurs de calcium (204) n’a pas influencé les effets induits par l’UNBS1450 ou par l’ouabaïne (Figure 30) tant au niveau de l’induction de l’apoptose qu’au niveau de la dégradation de Mcl-1. Ces résultats suggèrent que l’induction de l’apoptose par les GCs est liée à l’induction de la voie non-ionique. D’après la littérature, les effets anticancéreux des GCs sont souvent associés à la voie non-ionique via l’implication de kinases (3). Nous avons donc ensuite vérifié l’implication de la voie non-ionique et notamment l’importance de l’activation des kinases du signalosome suite à la fixation de glycosides cardiaques sur la pompe NKA.
2.2. Implication de la voie ionique dans les effets induits par l’UNBS1450
Il est connu que l’activation de la pompe NKA peut, soit activer la voie ionique et les flux de calcium, soit activer les kinases du signalosome. Dans le but de démontrer l’implication de
kinases en aval de l’activation de la pompe NKA dans la régulation de la voie non-ionique, nous avons exploré les effets des inhibiteurs de principales kinases qui peuvent intervenir dans le signalosome activé par la fixation des GCs sur la pompe NKA (208). Les travaux réalisés ont mis en évidence que l’inhibition de l’activité de la plupart de ces kinases diminue faiblement l’apoptose induite par l’UNBS1450, sans jamais conduire à une réversion complète (Figure 31). Ces résultats nous ont menés à chercher un mécanisme en amont de cette activation des kinases. La réversion partielle de l’apoptose suggère que l’inhibition d’une seule kinase ne peut pas être suffisante pour bloquer les effets de l’UNBS1450, et par conséquent que les effets de ce composé s’appuient sur l’activation simultanée de plusieurs kinases. Afin de prouver cette hypothèse, il serait important de vérifier si l’activité de ces kinases peut être modulée par l’UNBS1450 et si l’apoptose induite par cette molécule peut être modulée par la combinaison de plusieurs inhibiteurs de kinases. Dans le cas de l’ouabaïne, le co-traitement par des inhibiteurs de kinases reste sans effet, suggérant ainsi que les mécanismes impliqués lors du traitement à l’ouabaïne sont dépendants d’autres kinases ou encore d’autre paramètres qui restent à être étudiés.
Il est possible que ces kinases soient potentiellement impliquées en aval d’un premier évènement. Nous proposons donc d’étudier des événements se produisant en amont, dont probablement l’activation d’une autre famille de kinases.
La chélation du calcium lors d’un traitement avec l’UNBS1450 ne bloque pas les effets de ce composé sur l’apoptose et sur la dégradation de Mcl-1. L’inhibition des kinases, quant à elle, diminue faiblement l’induction de l’apoptose mais n’affecte pas la modulation de Mcl-1 induite par l’UNBS1450. Ces résultats n’excluent cependant pas l’implication d’autres mécanismes liés à la voie non-ionique.
2.3. La modulation du cholestérol est impliquée dans le mécanisme d’action de l’UNBS1450
La voie Src peut-être activée lorsque la pompe NKA fixe un GC (208). Lorsque la pompe NKA, qui séquestre Src au niveau des radeaux lipidiques se lie à son ligand, la kinase Src est libérée. Cette kinase pourra alors activer à son tour le signalosome y compris plusieurs kinases (i.e. Ras/ERK1/2) (208).
D’après la littérature, un changement de la teneur de cholestérol membraire peut altérer l’activité modulatoire de la pompe NKA sur Src, et par conséquent inhiber l’activation de Src par les GCs. Dans nos conditions expérimentales, un co-traitement avec l’UNBS1450 et le MBC, un modulateur du cholestérol membranaire (208) a conduit à une prévention très forte de l’induction de l’apoptose et de la diminution de Mcl-1 normalement observées lors d’un traitement à l’UNBS1450. Cependant, ce même chélateur reste sans effet sur l’apoptose et la dégradation de Mcl-1 induites par l’ouabaïne (Figure 32). Cette différence de modulation des effets du MBC induits par l’UNBS1450 et l’ouabaïne suggère que le mécanisme d’action de l’UNBS1450 dépend du niveau de cholestérol. Cependant, cette implication du cholestérol n’est valable que pour des concentrations d’UNBS1450 inférieures à 100 nM (Figure 33). En effet, pour des concentrations supérieures, le MBC n’est plus capable de réverser les effets pro-apoptotiques de l’UNBS1450 et suggère que dans ces conditions, l’UNBS1450 utilise d’autres voies de signalisation pour induire la mort cellulaire par apoptose.
Ces résultats ont été confortés en utilisant deux autres modulateurs du cholestérol (Figure 34). D’une part, la filipine III, un composé se fixant sur les molécules de cholestérol membranaires et inhibant la perméabilité membranaire et l’endocytose n’induit aucune modification significative des effets de l’UNBS1450 ou de l’ouabaïne. Contrairement au MBC, la filipine III ne permet pas la déplétion du cholestérol membranaire, mais empêche seulement les processus d’endocytose par sa fixation sur les molécules de cholestérol, sans détruire les radeaux lipidiques comme observé dans le cas de traitement avec le MBC.
L’utilisation d’un second modulateur de cholestérol, le U18666A en co-traitement avec l’UNBS1450 ou l’ouabaïne augmente le niveau d’apoptose induite par ces deux GCs par effet synergique. Comme le U18666A est connu pour inhiber le trafic du cholestérol et ainsi augmenter sa concentration lysosomale, il semblerait que cette augmentation du cholestérol lysosomal soit impliquée dans l’amplification des effets pro-apoptotiques de ces deux GCs. Comme cette augmentation est plus significative dans le cas de l’ouabaïne, il serait intéressant
d’étudier les effets de l’ouabaïne sur le lysosome, de manière à déterminer comment cet organite est touché par un traitement avec ce cardénolide. L’effet synergique moins marqué observé dans le cas de l’UNBS1450 suggère que ce glycoside cardiaque implique préférentiellement le cholestérol membranaire (radeaux lipidiques) que le cholestérol lysosomial dans son mécanisme d’action pro-apoptotique. Dans la littérature, il a été montré que l’ouabaïne pouvait induire l’internalisation de la pompe NKA et sa dégradation par le lysosome, montrant qu’il est connu que l’ouabaïne peut avoir des effets sur cet organite. De plus, il faut noter que ces effets sont insensibles à l’utilisation d’inhibiteurs de Src (218).
2.4. Evidences de l’implication de Src dans les effets induits par l’UNBS1450
D’après la littérature, l’ouabaïne permet l’activation de Src et ERK, notamment pour ses effets prolifératifs à faible concentration (219), aussi que d’autres kinases (220).
Afin de déterminer si Src est impliqué, en amont dans l’activation du signalosome, dans le mécanisme d’action de l’UNBS1450 et/ou de l’ouabaïne, nous avons utilisé un inhibiteur de Src (PP2) en co-traitement avec ces deux cardénolides. Un tel co-traitement avec l’inhibiteur de Src (PP2) induit une réversion partielle de l’induction de l’apoptose par l’UNBS1450, mais n’affecte pas celle induite par l’ouabaïne dans les lignées Jurkat et U937. Les résultats obtenus sont similaires à ceux observés après l’utilisation du dépléteur de cholestérol membranaire (MBC) sauf pour la concentration de 100 nM (Figure 35). En effet, PP2 induit une modulation constante (environ 50%) de l’effet pro-apoptotique de l’UNBS1450, pour des concentrations croissantes d’UNBS1450 et cet effet est maintenu pour des concentrations élevées de ce GC dans les lignées U937 et Jurkat étudiées (Figure 36). Ces résultats suggèrent que l’UNBS1450 peut induire l’apoptose en utilisant plusieurs voies notamment la voie impliquant Src, car son inhibition par PP2 diminue l’apoptose induite par l’UNBS1450.
Ces observations seront confirmées par l’analyse de l’expression et de l’activation de la kinase Src, ainsi que des kinases situées en aval de Src lors de traitement avec l’UNBS1450 et de co-traitements avec le MBC.
Contrairement à l’UNBS1450, l’ouabaïne semble induire ses effets par l’intermédiaire du lysosome, et ainsi, le fait que l’inhibiteur de Src n’ait pas d’effet sur ses effets pro-apoptotique, semble être cohérent avec la littérature, qui montre que l’internalisation et la
destruction de la pompe NKA par le lysosome, induit par l’ouabaïne, est indépendante de Src (218).
L’ensemble de ces résultats suggère que le mécanisme d’action pro-apoptotique de l’UNBS1450 implique Src et potentiellement son interaction avec la pompe NKA. Pour de faibles concentrations d’UNBS1450 (inférieures à 100 nM), le cholestérol membranaire est également impliqué. A contrario, le mécanisme d’action de l’ouabaïne implique le cholestérol lysosomal mais pas Src.