Importance de Mcl-1 dans l’induction de l’apoptose induite par l’UNBS1450

De manière à déterminer si la diminution d’expression de la protéine Mcl-1 suite aux traitements avec les glycosides cardiaques est impliquée dans l’induction de l’apoptose, les cellules ont été d’une part, transfectées avec un plasmide Mcl-1 permettant la surexpression de la forme sauvage de Mcl-1, et d’autre part avec un plasmide Mcl-1 KR comportant une mutation sur ses sites d’ubiquitination, qui empêche sa dégradation par le protéasome, normalement consécutive à son ubiquitination.

Les lignées U937 et Jurkat ne sont pas de bons modèles de transfection. En effet les premières sont difficilement transfectables, et la deuxième lignée ne maintient pas, au cours du temps, la surexpression de Mcl-1 induite par transfection (Figure 25). Cette étude a été par conséquent réalisée sur les cellules SH-SY5Y facilement transfectables et qui réagissent de manière similaire aux cellules U937 et Jurkat au traitement avec l’UNBS1450 (étude en cours au laboratoire LBMCC).

Les cellules SH-SY5Y ont été transfectées avec le plasmide permettant de surexprimer Mcl-1 WT (Mcl-1), puis avec le plasmide Mcl-1 KR. Les cellules SH-SY5Y transfectées mais non traitées montrent une bonne efficacité de transfection avec les deux plasmides testés (Figure 26). Ces cellules transfectées ont été traitées à 25 nM d’UNBS1450 pendant 16 h, le délai nécessaire pour obtenir une accumulation suffisante de cellules présentant une morphologie nucléaire apoptotique et un bon niveau de clivage des pro-caspases-3 et -7. L’analyse de l’expression de Mcl-1 et du clivage de la pro-caspase-3 et -7 par Western Blot, ainsi que de l’induction de l’apoptose par étude de la morphologie nucléaire, ont mis en évidence que la surexpression de la protéine Mcl-1, induite par transfection avec le plasmide Mcl-1 WT, est totalement supprimée après un traitement à l’UNBS1450 (Figure 26B) et que de plus, aucune réversion de l’apoptose, ni du clivage des pro-caspase-3 et -7 ne sont observés comparé au contrôle.

A

B

Figure 25 : Mise au point des transfections sur les lignées U937 et Jurkat

Les cellules ensemencées à 200 000 cellules/mL (U937 et Jurkat), dans une plaque 6 puits ont été transfectées avec Mcl-1 WT (A) ou MCL-1 KR (B) à l’aide du kit JetPrime pendant 16 h, puis ont été remises en culture dans un milieu en présence d’UNBS1450 pendant 24 h. L’apoptose a été analysée par étude de la morphologie nucléaire et de l’expression des protéines par Western Blot. Les résultats représentent la moyenne de pourcentage d’apoptose +/- ES (erreur standard). ** : p < 0,01 par ANOVA 1 – Sidak. EV : plasmide contrôle.

Les cellules SH-SY5Y ont ensuite été transfectées avec le plasmide Mcl-1 KR. Dans cette lignée, la présence de Mcl-1 mutée et non ubiquitinable, permet aux cellules de diminuer l’apoptose induite par l’UNBS1450 comme démontré par l’étude de la morphologie nucléaire et de la diminution du clivage des pro-caspases -3 et -7 comparé au contrôle. Par ailleurs, la surexpression de Mcl-1 est préservée malgré le traitement à l’UNBS1450.

Afin d’appuyer les observations précédentes suggérant une implication de l’ubiquitination de Mcl-1 dans le mécanisme d’action de l’UNBS1450, nous avons utilisé une autre stratégie expérimentale utilisant un inhibiteur de protéasome de manière à vérifier l’effet de l’UNBS1450 sur l’expression de Mcl-1 et l’induction de l’apoptose en inhibant la dégradation des protéines. Les cellules SH-SY5Y ont été traitées pendant 10 h (correspondant au temps minimum requis pour observer une diminution de Mcl-1 dans cette lignée cellulaire) avec 25 nM d’UNBS1450 puis pendant 6 h avec 5 µM d’inhibiteur du protéasome MG132 afin d’étudier l’induction de l’apoptose et le clivage des pro-caspases. Tout comme avec l’utilisation du plasmide Mcl-1 KR, l’inhibition du protéasome inhibe la dégradation de Mcl-1 par l’UNBS1450 et induit une réversion de l’apoptose cependant il n’y a pas de différence entre le clivage des procaspase-3 et -7 dans les cellules transfectées avec le plasmide contre ou Mcl-1 KR (Figure 27).

Ces expériences montrent que dans la lignée SH-SY5Y, il semble exister un lien entre la présence de Mcl-1 et l’induction de l’apoptose induite par l’UNBS1450. Par ailleurs, la dégradation de Mcl-1 par l’UNBS1450 semble impliquer et nécessiter l’induction de l’ubiquitination de Mcl-1 par l’UNBS1450.

A

B

Figure 26 : Effet de l’UNBS1450 lors d’une surexpression de Mcl-1 dans la lignées SH-SY5Y

Les cellules ensemencées 300 000 cellules/mL, dans une plaque 6 puits ont été transfectées avec Mcl-1 WT ou MCL-1 KR à l’aide du kit JetPrime pendant 24 h, puis ont été remises en culture dans un milieu en présence d’UNBS1450 pendant 24 h. L’apoptose a été analysée par étude de la morphologie nucléaire et de l’expression des protéines par Western Blot. Les résultats représentent la moyenne de pourcentage d’apoptose +/- ES (erreur standard). ** : p < 0,01 par ANOVA 1 – Sidak. EV : vecteur vide. A : Transfection des SH-SY5Y avec le plasmide Mcl-1 WT. C, Transfection des cellules SH-SY5Y avec le plasmide Mcl-1 KR.

A

B

Figure 27 : Effet de l'UNBS1450 lorsque le protéasome est inhibé

Les cellules ont été ensemencées à 300 000/mL dans une plaque 6 puits, et traitées avec 25 nM d’UNBS1450 pendant 10 h, puis pendant 6h avec 5 µM MG132. L’apoptose a été

analysée par l’étude de la morphologie nucléaire par microscopie et l’expression des protéines par Western blot. A, Analyse de l’activité du protéasome « Cell-Based Proteasome

Glo Assay » lors de traitement au MG132 .B, Analyse de l’apoptose par l’étude de la

morphologie nucléaire et de l’expression de Mcl-1 et des caspases-3/7 par Western blot. Les résultats sont exprimés en moyenne (+/- SE) de pourcentage de cellules apoptotiques. Les expériences ont été répétées 3 fois. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.001 par ANOVA 2 – Dunnett, comparé au contrôle respectif.