Matériels et Méthodes

Le minerai de fer intact et un échantillon naturel de sidérite (roche riche en sidérite) ont été utilisés. Étant plus riches en Fe(II) que le minerai vieilli, leur oxydation devrait être plus facile à déceler et à quantifier que le minerai vieilli qui, étant très peu concentré en Fe(II) (environ 5% Fe(II)/FeTOT), n'a pas été considéré ici.

4-2-1- Préparation des échantillons

Un lavage à l'acide chlorhydrique 0,5 M a été réalisé pendant 10 min sous agitation en condition anoxique. La poudre a été ensuite centrifugée à 14500 rpm pendant 5 min puis rincée à l'eau distillée préalablement dégazée par barbotage d'azote et équilibrée en condition anoxique. La poudre ainsi lavée a été séchée dans un dessiccateur. Cette poudre a été utilisée pour les incubations avec les différentes souches bactériennes sélectionnées ou en condition abiotique.

4-2-2- Préparation des souches

Cette préparation est décrite dans le Chapitre 2. Les souches sélectionnées sont

Acidithibacillus ferroxidans (At. ferroxydans - acidophile), Rhodopseudomonas palustris

souche TIE-1 (dite TIE-1 par la suite - phototrophe), Acidovorax sp. souche BoFeN1 (dite BoFeN1 par la suite - nitrate réductrice) et Klebsiella mobilis (nommée également

Enterobacter aerogenes, nitrate réductrice).

Lors des incubations, le milieu minéral (sans Fe(II)) du milieu de culture DSMZ 882 a été utilisé pour At. ferroxidans (« milieu AtF »), le milieu spécifique à 1 pour la souche TIE-1 et le milieu spécifique à BoFeNTIE-1 et K. mobilis (« milieu LPM »). La composition de ces différents milieux est donnée dans le Chapitre 2 (Tableau 3, 4 et 5). En raison du temps imparti pour terminer les expériences, ces milieux ont été choisis par rapport à l'eau de mine synthétique afin d'assurer les conditions de réactions optimales des différentes souches.

4-2-3- Préparation des incubations

La mise en place des suspensions a eu lieu en milieu stérile, sous condition anoxique pour les souches TIE-1, BoFeN1 et K. mobilis et à la flamme (bec Bunsen) pour At. ferroxydans. Deux cent cinquante grammes de minerai de fer et sidérite, préalablement lavés à l'HCl, ont été ajoutés à 80 mL de chaque milieu. Le pH des solutions a été contrôlé et ajusté à 7 (sauf At. ferroxydans, pH 3). Les suspensions ont ensuite été inoculées à 1 × 10⁷ cellules mL^-1 environ pour TIE-1, BoFeN1 et K. mobilis et 1 × 10⁹ cellules mL^-1 pour At. ferroxydans. Une fois

123 inoculés, les flacons de l'essai TIE-1 ont été placés à 20°C et sous excitation lumineuse (ampoule incandescente qui émet un spectre lumineux dans les longueurs d'ondes 590 et 870 nm afin d'exciter les caroténoïdes et la bactériochlorophylle α, Jiao et al., 2005). Au préalable, un barbotage d'hydrogène (80/20 H2/N2, Messer) a été réalisé afin de stimuler la croissance et l'oxydation du Fe(II) comme suggéré par Jiao et al. (2005). Dix millimolaires d'acétate de sodium et de lactate de sodium ont été ajoutés dans les flacons inoculés avec BoFeN1 et K. mobilis, respectivement, ainsi que 10 mM de nitrate (NaNO3). Ces deux essais ont été placés à l'obscurité et 30°C. Les essais d'oxydation par At. ferroxydans ont été placés sous agitation (250 rpm) dans deux atmosphères distinctes : atmosphère aérobie (21% d'O2, 20°C) et atmosphère micro-aérobie en chambre hypoxie (CoyLab) avec 4% d'O2 (20°C). Chaque flacon a été protégé de la lumière par un film d'aluminium afin d'optimiser la croissance (communication personnelle du Dr Christian Mustin, LIEC, Université de Nancy). Du coton cardé a été utilisé afin de favoriser les échanges gazeux entre l’espace de tête du flacon et l'atmosphère environnante tout en conservant la stérilité. Il est à noter que la chambre hypoxie possède une atmosphère N2-O2. Or, afin que At. ferroxydans oxyde le Fe(II) dans les mêmes conditions qu'en atmosphère "normale", du CO2 est nécessaire. Le CO2 a été apporté en faisant réagir dans la chambre hypoxie, 75g de carbonate de sodium (NaHCO3) et du HCl (6M) en excès, selon l'équation suivante:

NaHCO3 + HCl → CO2(g) + NaCl (s) + H2O (3)

Soit une concentration finale en CO2 d'environ 400 ppm dans la boîte hypoxie.

4-2-4- Oxydation par l'O₂ atmosphérique

Afin d'étudier l'impact de l'oxygène, les minerais (250 mg de minerai de fer intact et sidérite) ont été dispersés au sein de 50 mL du milieu de culture pour BoFeN1 (pH 7) et le milieu AtF (pH 3). Les suspensions ont été agitées à l'aide de barreaux magnétiques (300 rpm) en condition atmosphérique (21% d'oxygène) et dans une boîte hypoxie (4% d'oxygène, Coy Laboratory) et 20 °C. L'évaporation a réduit de 50% le volume de chacun des flacons et après deux ajouts de milieu afin de rectifier le volume au volume initial, l'expérience a été arrêtée. Une expérience sans agitation, 21% d'oxygène et 20 °C a également été mise en place afin de connaître l'influence potentielle de l'agitation sur la vitesse d'oxydation.

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4-2-5- Oxydation par le peroxyde d'hydrogène

Le peroxyde d'hydrogène est un oxydant puissant. Son utilisation a été testée afin de préparer les expériences du Chapitre 5 En effet, il est plus réactif que le dioxygène. Deux cent cinquante milligrammes de minerai de fer intact et de sidérite naturelle ont été mélangés avec 50 mL de H2O2 à 35%. La réaction est très exothermique avec dégagement de chaleur et de vapeur. La réaction a été réalisée pendant 24h à 20°C. Le volume étant très faible à la fin de la réaction, l'équivalent du volume évaporé a été ajouté afin d'effectuer le prélèvement. L'échantillon a été rincé plusieurs fois à l'eau distillée afin de stopper complètement la réaction.

4-2-6- Oxydation par les nitrates et nitrites (réactions abiotiques) sur Fe(II) soluble

En condition anaérobie et dans 60 mL de milieu LPM préalablement dégazé à l'azote, 10 mM de Fe(II) soluble (FeCl2 - solution mère à 1 M, dégazée) ont été ajoutés ainsi que 10 mM de nitrates (NaNO3) et de nitrites (NaNO2) respectivement (solution mère à 1M, dégazée). Le pH a été ajusté à 7,0 ± 0,1. Les flacons ont été placés à 30°C et à l'obscurité pendant la réaction. Une expérience d'oxydation de la sidérite naturelle par les nitrites a été également mise en place avec 50 et 100 mM de NO2

-Nota: A cause de la colonne échangeuse d'anions vieillissante, certaines pannes sont survenues sur l'HPLC, retardant les dosages. Par conséquent, les nitrites ont réagi avec le Fe(II) présents dans les tubes de prélèvement; Ceci entraine un sous estimation de la concentration en nitrites pour les prélèvements à 0, 1, 2 et 3 jours. Une solution, trouvée tardivement, est d'exposer les tubes de prélèvement à l'air libre afin que l'oxygène réagisse avec le Fe(II) et avant les nitrites (Weber et al., 2001).

4-2-7- Dosage du Fer, des nitrates et des nitrites.

Ces dosages ont été réalisés conformément aux méthodes décrites dans le Chapitre 2 (p 10 et 11): un dosage par la ferrozine pour le fer (Fe(II) et FeTOT) et par HPLC pour les nitrates et les nitrites. Les ions ammoniums ont été dosés par le dosage colorimétrique utilisant des solutions de salicylate et nitropusside (Baethgen and Alley, 1989).

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