Matériel et méthode

L'utilisation et l'hébergement des animaux pour cette expérience respectent les règles du Guide des soins et de l'utilisation des animaux d'expérimentation du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université Laval. Les souris transgéniques surexprimant la mutation G37R-SOD1 (B6.Cg-Tg (SOD1*G37R)29Dpr/J) et celles surexprimant la hSOD1WT _{(C57BL/6-Tg(SOD1)3Cje/J) ont été achetées chez Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME,}

USA). Les souris ont été maintenues hétérozygotes par croissement avec des souris C57BL/6.

Évaluation du score clinique et analyse de la progression de la maladie

Une évaluation des réflexes des membres postérieurs et une mesure des poids ont été utilisées pour évaluer le score clinique et l'effet de la mutation et du traitement sur les souris tgSOD1WT et hSOD1G37R_{. Les réflexes posturaux et la capacité d'extension des membres postérieurs ont été}

évalués tel que décrit dans la littérature (Urushitani, Sik et al. 2006). L'évaluation du score et la prise des poids se sont effectués une fois par semaine par du personnel compétent et formé pour ce genre d'évaluation et ce, à l'aveugle.

Tableau 4.1 Grille pour déterminer le score neurologique

Pointage Critères

5 Complète extension des pattes arrières (plus de 2 secondes) avec une posture normale lorsque la souris est maintenue par la queue.

4 Extension partielle des pattes arrières (faiblesse) ou tremblement des pattes arrières lorsque la souris est maintenue par la queue.

3,5 Légère difficulté à marcher caractérisée par l’affaissement des hanches.

3 Les orteils se recourbent plus de deux fois ou toute autre partie du pied qui glisse sur la table lorsque la souris marche sur une distance de 30 cm.

2,5 L’une des pattes arrières est paralysée et ne sert plus au mouvement.

2 Rigidité et mouvement des jointures minimal, les pieds ne sont plus utilisés pour générer un mouvement vers l’avant.

1 La souris n’est plus capable de se retourner en dedans de 15 secondes lorsque celle- ci est placée sur le côté.

0 Stade terminal de la maladie. Immunisation active

Trois doses de peptide ont été administrées aux souris sur une période de 12 semaines. Les injections et les prélèvements sanguins ont été réalisés en alternance aux 2 semaines, soit en respectant le cycle suivant : injection, 2 semaines d'attente, prélèvements, 2 semaines d'attente, injection et ainsi de suite (Figure 3.1). Le protocole d'immunisation a été amorcé lorsque les souris étaient âgées de 8 semaines. 17 souris hSOD1G37R _{et 18 souris tgSOD1WT ont été utilisées pour}

l'expérience. Le peptide utilisé pour cette expérience est le P14FGL-LLH (séquence : SVISLSGDHCIIGR) (KLH-peptide SOD1cys) (Sheldon Biotech) à une concentration initiale de 2 mg/ml. Le Sigma Adjuvant System®_{(Sigma-Aldrich a été émulsionné à l'aide d'une solution de NaCl}

0.9% stérile avant d'être utilisé. La solution de peptide utilisée pour l'injection, diluée dans l'adjuvant, était à une concentration de 0.25 mg/ml. Lors de la première immunisation, 9 souris hSOD1G37R _{et 9}

souris tgSOD1WT ont reçu 50 µg (0.2 ml en deux injections à des endroits distincts) du peptide solubilisé par injections sous-cutanées. Deux doses de rappel de 25 µg ont été administrées à 4 semaines d'intervalle. Des prélèvements sanguins de 150 µl ont été effectués via la veine faciale à l'aide d'une seringue hypodermique de 20G. Suite à ces prélèvements, chacune des souris a reçu 450 µl de lactate de Ringer (Hospira) dans le but de stimuler la régénération des fluides sanguins. Suite au dernier prélèvement sanguin (J70), les souris ont été laissées en observation jusqu'à atteinte du poids limite ou d'un score neurologique trop bas. L'évaluation a été réalisée telle que décrite précédemment.

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Figure 4.1 Design expérimental

Quatre prélèvements sanguins, soit un 7 jours avant le début de l'immunisation et trois à 14, 42 et 70 jours post-immunisation, ont été prévus dans le but de suivre de façon longitudinale le développement des anticorps, qui ont été titrés par ELISA. L'injection initiale de peptide KLH-peptide SOD1cys a été effectuée à jour 0, qui correspond au début de l'expérience. Deux doses de rappel ont été administrées aux jours 28 et 56, dans le but de favoriser une plus grande réponse immunitaire. Suite au dernier prélèvement sanguin, les souris sont laissées en observation jusqu'à l'atteinte d'un point critique, moment où elles seront sacrifiées.

Tableau 4.2 Récapitulatif des groupes expérimentaux

Souris hSOD1G37R _{Souris tgSOD1WT}

Saline + adjuvant KLH-peptide SOD1cys + adjuvant

Saline + adjuvant KLH-peptide SOD1cys + adjuvant

8 9 9 9

Prélèvements des tissus

Les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane (Baxter) et euthanasiés au CO2, tel que prévu au

protocole de recherche approuvé par le comité d'éthique. Certains cerveaux et moelles épinières ont été prélevés et congelés à -80°C dans le but d'en extraire les protéines tandis que d'autres ont été post-fixés pour 24h dans la paraformaldéhyde 4% et équilibrés dans une solution de sucrose 30% pour 48h afin de les inclure dans l'OCT et éventuellement faire des immunofluorescences.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Les titres d'anticorps de chacune des souris aux différents prélèvements ont été déterminés par ELISA. Le fond des plaques a été enduit du peptide KLH-peptide SOD1cys préalablement dilué dans du PBS à une concentration de 10 µg/ml. Les plaques enduites ont été incubées avec 100 ul de sérum, isolé suite aux prélèvements sanguins, dilué dans une solution 1% BSA/PBS. L'immunodétection a été réalisée via un anticorps anti-souris conjugué à la peroxydase (Thermo Scientific™ Pierce™). La densité optique a été mesurée à 405 nm.

Immunofluorescence

Les moelles épinières préalablement incorporées dans l'OCT (Sukura, Finetek U.S.A., Inc.) ont été coupées en tranches de 20 µm au cryostat (Leica) et les lames ont été conservées à –20°C jusqu'à utilisation. Une étape de perméabilisation a été réalisée avec du KPBS (contenant 0.5% (v/v) Triton X-100 (Bio-Rad). L'anticorps primaire utilisé est un anticorps primaire de souris anti-SOD1 mal repliée (A5C3) (Gros-Louis, Soucy et al. 2010). L'anticorps secondaire utilisé est un anticorps de chèvre anti-souris IgG Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific).

Analyses statistiques

Les résultats ont été analysés avec le logiciel Prism 5.0 (Graphpad software, LaJolla, CA). Les données de survie ont été analysées en utilisant un test Mantel-Cox log-rank et les données de comportement par une analyse de la variance à deux facteurs (two-way ANOVA) suivi d'un post-test de Bonferroni.

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