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Protéines mal repliées et stress associé au réticulum endoplasmique : implications dans la pathogénèse de la sclérose latérale amyotrophique

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Academic year: 2021

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Protéines mal repliées et stress associé au réticulum

endoplasmique : implications dans la pathogénèse de la

sclérose latérale amyotrophique

Mémoire

Audrey Labarre

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire

Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

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Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF. Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette maladie encore incurable.

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Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable disease.

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Table des matières

Résumé ... iii

Abstract ... v

Table des matières ... vii

Liste des tableaux ... ix

Liste des figures ... xi

Liste des abréviations... xiii

Remerciements ... xvii

Avant-propos ... xix

Chapitre 1 : Introduction et problématique ... 1

1.1 La sclérose latérale amyotrophique ... 3

1.1.1 Description générale ... 3 1.1.2 La SLA familiale ... 4 1.1.3 La SLA sporadique ... 10 1.2 L’étiologie de la SLA ... 10 1.2.1 La toxicité de la SOD1 ... 10 1.2.2 Protéinopathie TDP-43 et FUS ... 14 1.2.3 Facteurs environnementaux ... 16

1.3 Le stress associé au réticulum endoplasmique ... 17

1.3.1 La réponse aux protéines mal repliées ... 17

1.3.2 Composés connus pour induire un stress au réticulum endoplasmique ... 21

1.4 Les modèles animaux de la SLA ... 22

1.5 Immunothérapie ... 25

1.6 Problématique et hypothèses de travail ... 26

Chapitre 2 : Des inclusions cytoplasmiques de TDP-43 sont détectés dans les neurones moteurs murins NSC-34 traités au curcuma ... 29 2.1 Résumé ... 31 2.2 Abstract ... 32 2.3 Introduction ... 33 2.4 Experimental procedures ... 34 2.5 Results ... 36 2.6 Discussion ... 40 2.7 Acknowledgements ... 41

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2.8 References ... 42

Chapitre 3 : L’immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique ... 45

3.1 Résumé ... 46

3.2 Abstract ... 46

3.3 Introduction ... 47

3.4 Éléments cruciaux à considérer pour le développement d’une immunothérapie ... 51

3.5 Les approches d’immunisation pour la SLA causée par des mutations dans le gène SOD1 ... 53

3.6 Discussion et perspectives futures ... 55

3.7 Remerciements et financements ... 56

3.8 Références ... 57

Chapitre 4 : Développement d'une immunothérapie ciblant la protéine SOD1 mal repliée pour le traitement de la SLA ... 59

4.1 Introduction ... 61

4.2 Matériel et méthode ... 62

4.3 Résultats ... 66

4.4 Discussion ... 70

Chapitre 5 : Conclusion et perspectives ... 73

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Liste des tableaux

Tableau 1.1 Principaux loci et gènes mutés identifiés chez les patients atteints de SLAF ... 6

Tableau 1.2 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLAF ... 24

Tableau 3.1 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLA ... 48

Tableau 4.1 Grille pour déterminer le score neurologique ... 63

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Liste des figures

Figure 1.1 Le système moteur humain et son implication dans la SLA ... 4

Figure 1.2 Représentation tridimensionnelle de la SOD1 ... 5

Figure 1.3 Mutations de la SOD1 en lien avec la SLAF ... 7

Figure 1.4 Mutations de la TDP-43 en lien avec la SLA ... 9

Figure 1.5 Modèle de toxicité de la SOD1 impliquant son mauvais repliement et l'agrégation protéique ... 12

Figure 1.6 Contribution des différents types cellulaires au développement de la SLA ... 14

Figure 1.7 Modèle de protéinopathie de TDP-43 ... 16

Figure 1.8 Représentation schématique des voies de signalisation initiées par les trois branches de l'UPR ... 19

Figure 2.1 Curcumin treatment causes a increase of the mortality rate ... 37

Figure 2.2 Curcumin-treated cells induced GRP-78 expression and cytoplasmic TDP-43 accumulation ... 39

Figure 2.3 Cytoplasmic TDP-43 accumulation detected in curcumin-treated cells ... 40

Figure 3.1 Modèle de toxicité associé au mauvais repliement de la protéine SOD1 et à son agrégation ... 50

Figure 3.2 Réaction immunitaire spécifique résultant de différentes stratégies d’immunisation ... 52

Figure 4.1 Design expérimental ... 64

Figure 4.2 Immunisation des souris SOD1G37R et tgSOD1WT avec le peptide cystéine (SOD1cys111) ... 67

Figure 4.3 Titre des anticorps des souris hSOD1G37R immunisées ... 68

Figure 4.4 Des agrégats protéiques SOD1 positifs sont détectables chez les souris tgSOD1WT ayant reçu le peptide KLH-SOD1 cys111 ... 69

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Liste des abréviations

ALS: Amyotrophic lateral sclerosis ANOVA: Analysis of variance

ATF6: Activating transcription factor 6 BGS : Bovine growth serum

BHE: Barrière hémato-encéphalique

CIHR: Canadian Institutes of Health Research Cu: Cuivre

Cys: Cystéine

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DLFT: Dégénérescence lobaire frontrotemporale DMSO: Dimethyl sulfoxide

EDTA: Éthylène diamine tétra acétique ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay ER: Endoplasmic reticulum

ERAD: Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation FALS: Familial amyotrophic lateral sclerosis

FRQS: Fonds de recherche du Québec - Santé FUS: Fused in sarcoma

GRP-78/Bip: Glucose-regulated protein 78/B-cell immunoglobulin binding protein GTP: N-acétylglucosamine phototransférase

IgG: Immunoglobuline G

Ire1: Inositol-requiring enzyme 1 IRES: Internal ribosome entry site

IVIG: Immunoglobulines intraveineuses KO: knock out

NFL: Neurofilament light chain

OCT: Optimal Cutting Temperature compound

PERK: Protein kinase RNA-activated (PKR)-like ER kinase RE: Réticulum endoplasmique

ROS: Espèces réactives d'oxygène

SALS: Sporadic amyotrophic lateral sclerosis

scFv: fragments fonctionnel d’anticorps à domaine unique SDS: Sodium dodecyl sulfate

SLA: Sclérose latérale amyotrophique

SLAF: Sclérose latérale amyotrophique familiale SLAS: Sclérose latérale amyotrophique sporadique SNC: Système nerveux central

SOD: Superoxyde dismutase

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SOD2: Mn superoxyde dismutase 2, mitochondriale SOD3: Cu/Zn superoxyde dismutase 3, extracellulaire TDP-43: Tar-DNA binding protein 43

UPR: Unfolded protein response WT: wild-type

XBP1: X-box binding protein 1 Zn: Zinc

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Un adulte créatif est un enfant qui a survécu ... ou un scientifique qui ira loin.

- Ursula K. Le Guin, avec le grain de sel d'Amélie Langlois

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Remerciements

J'aimerais tout d'abord remercier Dr François Gros-Louis, mon directeur de recherche, pour la liberté, le soutien et la confiance qu'il m'a accordé tout au long de ma maîtrise. Merci pour tout, vraiment. Merci également à Dr François Berthod, mon codirecteur, pour son soutien et ses bons conseils. Merci aux membres de mon équipe de recherche, plus particulièrement à Lydia Touzel Deschênes et Bastien Paré, pour leur écoute, leur aide et leur bonne humeur. Merci à Sabrina Bellenfant, de mon équipe de recherche "étendue", pour ses conseils et ses fous rires.

Un merci tout spécial à Sophie Laffray. Ma belle Sophie, merci de m'avoir enseigné la rigueur, la passion et la détermination. Et surtout, merci de m'avoir fait réaliser que la bonne science et les bons scientifiques ne font pas toujours partie des gros journaux. La roue tourne. Merci pour cette phrase qui me motive sans cesse. Merci à Marie-Josée Beaudet, pour ta patience et ta passion de la science. Tes enseignements me resteront en mémoire longtemps.

Merci à PETER PETER et Gab Paquet pour votre musique. Crier vos chansons à tue-tête a grandement contribué à ce que je garde le cap.

Merci à Nad, ma coloc, pour l’ensemble de l’œuvre. Ma vie ne serait pas la même sans toi. Merci d’avoir ensoleillé mes soirées avec nos fous rires et nos jasettes qui durent des heures. Merci aussi à Marie-Ève qui, de Montréal, a su m'encourager et me soutenir malgré la distance. Je reviens au bercail. Nos meilleures années d'amitié sont à venir, j'en suis certaine.

Merci aux amis du LOEX, plus particulièrement à Lorène Mottier, Pascal Morissette-Martin, Sébastien Cadau, Kim Aubin et Julie Bérubé. Lorène, merci pour tous ces moments à se supporter l'une l'autre. Merci pour tous nos fous rires et nos conneries. Ton amitié est très précieuse à mes yeux. Ça valait la peine de faire un saut à Québec pour mes études juste pour te connaître. On skype mon amie ! Pascal, mon "bro" du baccalauréat, merci pour tous ces beaux moments à rire simplement qu'en se regardant. On ne se lâche pas. L'Ontario, c'est à côté ! Kim, merci d'avoir égayé l'ambiance du bureau. J'ai adoré mes 2 années à tes côtés, à rire et à pleurer. Julie, merci pour ces

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soirées "vino-ventilation" qui m'ont fait le plus grand bien. Finalement, merci Seb, tu es vraiment le grand frère que je n'ai jamais eu.

Merci à vous, papa et maman, de m'avoir encouragé dans mes millions de projets plus fous les uns que les autres et de m'inciter à repousser sans cesse mes limites. Vous motivez chacune de mes décisions. Vos encouragements sont ce qui m'est le plus précieux au monde.

Merci à ma soeur, Laurence, pour qui j'ai une admiration sans borne. C'est moi la grande soeur, mais c'est vraiment toi mon modèle.

Merci à Marraine et Grand-maman, votre amour et votre soutien sont très importants pour moi. Et finalement, merci à mes amis (qui sauront se reconnaître). Vous êtes la preuve vivante que l’on a pas besoin d’être des désamorceurs de bombe pour en désamorcer une (genre moi en état de panique).

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Avant-propos

Le chapitre 2, intitulé « Des inclusions cytoplasmiques de TDP-43 sont détectés dans les neurones moteurs murins NSC-34 traités au curcuma » est le manuscrit d'un article qui sera soumis en novembre 2014 à la revue Canadian Journal of Neurological Sciences qui aura pour titre TDP-43 cytoplasmic inclusions detected in curcumin-treated NSC-34 motor neurons like cells. Pour cet

article, j'ai réalisé toutes les expériences et la conception de toutes les figures, en plus de contribuer à environ 80% de la rédaction.

Le chapitre 3, intitulé « L’immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique » est un article de revue paru dans la revue Médecine Science Amérique, numéro CRCQ 2012 (Vol.2, No.2) le 18 juin 2013. Cet article est en lien direct avec le chapitre 4, intitulé « Développement d'une immunothérapie ciblant la protéine SOD1 mal repliée ». J'ai participé à environ 50% de la rédaction.

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1.1 La sclérose latérale amyotrophique

1.1.1 Description générale

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par la dégénérescence sélective des neurones moteurs supérieurs et inférieurs de la moelle épinière et du cerveau. Les neurones moteurs communiquent directement avec les muscles par la formation d’une synapse neuromusculaire (aussi appelée jonction neuromusculaire) et sont chargés de contrôler les muscles volontaires du corps humain. La neurodégénérescence et les dysfonctions qui y sont associées conduisent progressivement à une faiblesse des muscles et une atrophie, qui conduira à son tour à une paralysie puis à la mort du patient (Mulder, Kurland et al. 1986; Ilieva, Polymenidou et al. 2009) (Figure 1.1). Cette maladie, caractérisée pour la première fois en 1874 par Jean-Martin Charcot, est la maladie des neurones moteurs, se déclenchant à l'âge adulte, la plus fréquente (Tandan and Bradley 1985; Rowland 2001; Wijesekera and Leigh 2009). Elle est également appelée maladie de Charcot en France et maladie de Lou Gehrig aux États-Unis, en l'honneur du célèbre joueur des Yankees de New York qui en est décédé (Rowland 2001). Les patients développant les premiers symptômes de la maladie sont âgés, en moyenne, entre 50 et 60 ans et le décès survient généralement 3 à 5 ans suite au diagnostic de la maladie, principalement causé par des défaillances au niveau du système respiratoire (Mulder, Kurland et al. 1986; Shaw 2001; Boillee, Vande Velde et al. 2006).

La SLA se présente sous deux formes, soit la SLA familiale (SLAF), avec des antécédents familiaux répertoriés, et la SLA sporadique (SLAS), majoritairement avec une étiologie non identifiée. Près de 10% des patients souffrent de la forme familiale et 90% de la forme sporadique, avec une prévalence estimée, respectivement, entre 0.4 et 1.8 pour 100 000 à travers le monde, à l'exception de la péninsule japonaise de Kii et de l'Île de Guam, où la prévalence est nettement plus élevée (Mulder, Kurland et al. 1986). Bien que certaines études tendent à montrer un lien entre l'exposition aux métaux lourds, tels que le plomb et le mercure, l'exposition aux pesticides ou à certains composés chimiques nocifs, et les maladies neurodégénératives, il n’y a pas encore de causes dites environnementales clairement établies (Johnson and Atchison 2009). Cependant, de nombreuses évidences pointent en ce sens, en raison de la prévalence de la maladie plus élevée non seulement

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chez les habitants de la péninsule de Kii mais aussi chez les joueurs de soccer et les militaires (Chio, Calvo et al. 2009; Beghi 2013; Trojsi, Monsurro et al. 2013).

Figure 1.1 Le système moteur humain et son implication dans la SLA

La dégénérescence sélective des neurones moteurs supérieurs du cortex moteur conduit à l'apparition de symptômes tels que les difficultés d'élocution et les problèmes de déglutition. Quant à elle, la dégénérescence des neurones moteurs du tronc cérébral et de la moelle épinière conduit à une faiblesse musculaire et éventuellement, à l'atrophie des muscles (Adapté de (Shaw, 2001).

1.1.2 La SLA familiale

La SLA familiale représente près de 10% des cas totaux de SLA. La découverte, en 1993, de mutations dans le gène SOD1 chez certains patients atteints de SLAF a orienté la recherche dans le domaine depuis de nombreuses années (Rosen, Siddique et al. 1993; Gurney, Pu et al. 1994). Plus récemment, des mutations dans trois autres gènes, soit TARDBP, FUS/TLS et C9ORF72, ont également été identifiées chez des patients atteints de la SLA (Kabashi, Valdmanis et al. 2008;

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Sreedharan, Blair et al. 2008; Vance, Rogelj et al. 2009; DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). De rares mutations dans certains gènes ont également été répertoriées, mais elles ne représentent qu'un faible pourcentage des causes de la SLAF (Gros-Louis, Gaspar et al. 2006). À ce jour, plus d'une vingtaine de gènes sont associés à cette pathologie (Tableau 1.1) (Millecamps, Salachas et al. 2010).

1.1.2.1 La superoxyde dismutase 1

La Cu/Zn superoxyde dismutase 1 (SOD1) est une enzyme antioxydante ubiquitaire de la famille des superoxydes dismutases (SOD) qui comporte trois membres : la Cu/Zn SOD cytosolique (SOD1), la SOD à manganèse se trouvant dans les mitochondries (SOD2) et la Cu/Zn SOD extracellulaire (SOD3). La SOD1 catalyse la dismutation du superoxyde (O2-) en peroxyde (H2O2), en oxygène

diatomique (O2) et en eau (H2O) (Valentine, Doucette et al. 2005). Elle se présente sous la forme

d'un homodimère incorporant un ion de cuivre et un ion de zinc par monomère (Figure 1.2).

Figure 1.2 Représentation tridimensionnelle de la SOD1

L'homodimère SOD1 est formé de deux monomères liés via des ponts disulfures (en vert). Chaque sous-unité lie un ion de cuivre (en orange) et un ion de zinc (en bleu). Une sous-unité est composée de huit feuillets béta qui permettent ainsi la formation d'un baril béta. Le site de liaison au zinc (en violet) et la boucle électrostatique (en jaune), sont les deux principaux éléments fonctionnels de la protéines (Adapté de (Rotunno and Bosco 2013).

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Tableau 1.1 Principaux loci et gènes mutés identifiés chez les patients atteints de SLAF

Locus Gène(Référence) Protéine/Fonction Caractéristiques

ALS1 SOD11 Superoxyde dismutase 1 (SOD1)/ Enzyme

de détoxification AD/AR, forme adulte

ALS2 ALS22 Alsin/ facteur d'échange de

nucléotide guanylique sur rho AR, forme juvénile

ALS4 SETX3 Senataxine/ Hélicase ADN/ARN AD, forme juvénile

ALS5 SPG114 Spatacsine/ Protéine transmembranaire AR, forme juvénile

ALS6 FUS5 Fused in sarcoma (FUS)/ Liaison à l'ARN,

épissage des exons et réparation de l'ADN AD, forme adulte

ALS7 Inconnu6 Inconnu AD, forme adulte

ALS8 VAPB7 Vesicule-associated membrane

protein-associated protein B/ Trafic vésiculaire AD, forme adulte

ALS10 TARDBP8 TDP-43/ Répresseur de la transcription et

régulation de l'épissage AD, forme adulte

ALS12 OPTN9 Optineurine/ Tension oculaire, trafic

vésiculaire AD/AR, forme adulte

ALS14 VCP10 Valosin-containing protein/ Liaison à l'ATP,

vésicules de transport et de fusion AD, forme adulte

ALS15 UBQLN211 Ubiquiline 2/ Ubiquitination et dégradation Lié au chromosome X,

formes juvénile et adulte

ALS16 SIGMAR112

DAO13

PFN114

hnRNPA2B1/A115

Sigma non-opioid intracellular receptor/ Chaperonne du RE

D-amino acid oxidase/inconnu Profiline 1/ Polymérisation de l'actine,

liaison de l'actine

Ribonucléoprotéines nucléaires/maturation des ARNm, métabolisme et transport

AR, forme juvénile

AD, forme adulte AD, forme adulte

AD, forme adulte

ALS-FTD1 Inconnu16 Inconnu AD, forme adulte

ALS-FTD2 C9orf7217 Chromosome 9 cadre de lecture ouvert

72/inconnu AD/sporadique, forme adulte AD: autosomal dominant, AR: autosomal récessif. 1(Rosen, Siddique et al. 1993), 2(Hadano, Hand et al. 2001; Yang, Hentati et al. 2001), 3(Chen, Bennett et al. 2004), 4(Hentati, Ouahchi et al. 1998; Orlacchio, Babalini et al. 2010), 5(Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance, Rogelj et al. 2009), 6(Sapp, Hosler et al. 2003), 7(Nishimura, Mitne-Neto et al. 2004; Nishimura, Mitne-Neto et al. 2004), 8(Kabashi, Valdmanis et al. 2008; Sreedharan, Blair et al. 2008), 9(Murayama, Inoue et al. 1991), 10(Johnson, Mandrioli et al. 2010), 11(Deng, Chen et al. 2011), 12(Al-Saif, Al-Mohanna et al. 2011), 13(Mitchell, Paul et al. 2010), 14(Wu, Fallini et al. 2012), 15(Kim, Kim et al. 2013), 16(Hosler, Siddique et al. 2000), 17(DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Adapté de (Leblond, Kaneb et al. 2014).

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Le gène SOD1 est situé sur le chromosome 21q22.1 et s'étend sur près de 9.3 kilobases (kb) d'ADN génomique comprenant cinq exons codant pour une protéine de 153 acides aminés. La SOD1 humaine est d'un poids moléculaire de 32 kiloDalton (kDa), sous sa forme d'homodimère (Valentine, Doucette et al. 2005).

Il y a plus de vingt ans, le premier lien génétique entre la SLA et les formes mutées de la protéine SOD1 a été établi. Cette découverte constitue la première identification d'une cause de la SLAF (Rosen, Siddique et al. 1993). À ce jour, plus de 150 mutations faux-sens causatives de la SLA dans le gène SOD1 ont été identifiées et ce, dans tous les exons (Figure 1.3) (Saccon, Bunton-Stasyshyn et al. 2013). Ces mutations sont impliquées dans 15%-20% des cas de SLAF et dans environ 5% des cas de SLAS (Forsberg, Andersen et al. 2011).

Figure 1.3 Mutations de la SOD1 en lien avec la SLAF

En bleu, la séquence protéique des 153 acides aminés de la SOD1 sauvage, c'est-à-dire non mutée. Des mutations dans des segments clés de la protéine ont été identifiées en vert (interface du dimère), en mauve (cystéines impliquées dans la formation des ponts disulfures entre les sous-unités), en orange (acides aminés impliqués dans la liaison du cuivre) et en gris (acides aminés impliqués dans la liaison du zinc). Chaque mutation est indiquée au dessus de l'acide aminé correspondant (Adapté de (Saccon, Bunton-Stasyshyn et al. 2013)).

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8

1.1.2.2 C9ORF72

La découverte du gène C9ORF72, se trouvant à la phase ouverte de lecture 72 (open reading frame 72) sur le chromosome 9, a été identifié comme étant responsable de près de 50% des cas de SLAF (DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Une expansion répétée d'hexanucléotide GGGGCC dans le premier intron, soit l'intron entre les exons 1a et 1b non-codant, est à l'origine de la mutation. Un individu normal peut comporter jusqu'à 23 répétitions de cette séquence dans le gène C9ORF72 tandis que les patients atteints de SLAF porteurs de la mutation peuvent avoir jusqu'à 1600 répétitions de l'hexanucléotide dans le gène (Murray, DeJesus-Hernandez et al. 2011). À ce jour, la fonction de la protéine codée par le gène C9ORF72 n'est pas encore clairement identifiée.

1.1.2.3 TDP-43

Le gène TARDBP code pour la Tar-DNA binding protein 43 (TDP-43), une protéine nucléaire de liaison à l'ADN et à l'ARN de 414 acides aminés et d'un poids moléculaire de 43 kDa (Buratti and Baralle 2001; Buratti, Dork et al. 2001; Daoud, Valdmanis et al. 2009). Elle est principalement impliquée dans la répression de la transcription et l'épissage alternatif (Ou, Wu et al. 1995; Wang, Wang et al. 2004). Sa découverte, en 1995, est en lien avec son implication dans la modulation de l'expression génique du VIH-1 (Ou, Wu et al. 1995). TDP-43 possède deux motifs de reconnaissance à l'ARN, lui permettant ainsi de se lier tant à l'ADN qu'à l'ARN. De plus, elle possède un domaine C-terminal riche en glycine, permettant la liaison aux protéines (Wang, Wu et al. 2008; Chen-Plotkin, Lee et al. 2010). Cette région comporte l'essentiel des mutations non-sens associées avec la SLA. Une seule mutation se trouve dans le premier motif de reconnaissance à l'ARN (Figure 1.4) (Williams, Floate et al. 1988; Daoud, Valdmanis et al. 2009; Chio, Borghero et al. 2011). Chez les patients atteints de SLA, TDP-43 a été identifiée comme l'une des protéines majeures faisant partie des inclusions cytoplasmiques de protéines ubiquitinées dans les neurones. C’est pourquoi cette protéine sert à la confirmation post-mortem du diagnostic SLA par les pathologistes (Arai, Hasegawa et al. 2006; Neumann, Sampathu et al. 2006).

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Figure 1.4 Mutations de la TDP-43 en lien avec la SLA

Les mutations dans le gène TARDBP affectent essentiellement des acides aminés se trouvant dans la région riche en glycine de la protéine TDP-43, en C-terminal de cette dernière. En haut, une version schématique de la structure du gène TARDBP et de la protéine TDP-43 présentant les régions conversées. En bas, une portion de l'alignement de séquence en acides aminés de la protéine TDP-43 pour différentes espèces démontre la grande conservation en C-terminal. Les mutations associées à la SLAF sont indiquées en rouge et celles associées à la SLAS, en orange. (Mackenzie and Rademakers 2008).

1.1.2.4. FUS/TLS

Fused in sarcoma/translated in liposarcoma (FUS/TLS) est une protéine nucléaire de liaison à l'ADN

et à l'ARN de 546 acides aminés encodée par 15 exons. Son extrémité C-terminale est impliquée dans la liaison aux protéines et à l'ARN, tandis que sa portion N-terminale, riche en glycine, est impliquée dans l'activation de la transcription (Aman, Panagopoulos et al. 1996). Sa découverte en lien avec la SLA a permis, à ce jour, d'identifier une cinquantaine de mutations, toutes situées dans la région riche en glycine et en C-terminale de la protéine (Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance, Rogelj et al. 2009; Deng, Gao et al. 2014). La structure tridimensionnelle et la fonction de FUS/TLS très similaires à celles de TDP-43 suggèrent l'implication d'un mécanisme pathogénique similaire (Ling, Polymenidou et al. 2013). De plus, FUS/TLS a été identifiée dans des inclusions protéiques cytoplasmiques présentes dans la moelle épinière et le cerveau de patients atteints de SLA (Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance, Rogelj et al. 2009; Tateishi, Hokonohara et al. 2010)

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1.1.3 La SLA sporadique

Malgré tous les efforts de recherche, près de 90% des cas de SLA demeurent pour la vaste majorité sans cause connue. Cependant, une composante génétique serait tout de même impliquée dans plusieurs cas de SLAS. Bien que quelques gènes semblent être en lien avec la SLAS, tel que SOD1 et TARDBP, ces liens comptent pour un faible pourcentage des cas sporadiques totaux, ce qui sous-entend une maladie beaucoup plus complexe et multifactorielle que précédemment anticipée (Gros-Louis, Gaspar et al. 2006). À l'exception de quelques cas familiaux impliquant une co-morbidité avec une autre maladie neurodégénérative, les symptômes de la SLAF et de la SLAS sont pratiquement identiques. Cependant, quelques différences subtiles, mais des plus intéressantes, subsistent, telles que l'âge d'apparition plus précoce chez les cas de SLAF et le ratio homme/femme plus élevé pour les cas de SLAS (Haverkamp, Appel et al. 1995; Camu, Khoris et al. 1999).

1.2 L’étiologie de la SLA

1.2.1 La toxicité de la SOD1

De nombreuses hypothèses ont été soulevées dans le but d'expliquer la toxicité impliquant la SOD1. Alors que certaines équipes soutiennent que la SOD1 aurait une activité enzymatique aberrante (Beckman, Carson et al. 1993; Wiedau-Pazos, Goto et al. 1996; Cafe, Testa et al. 2000), d'autres soutiennent qu'elle se propagerait à la manière d'un prion (Munch, O'Brien et al. 2011; Grad and Cashman 2013) ou qu'elle induirait un dysfonctionnement au niveau des mitochondries (Pizzuti and Petrucci 2011; Pickles, Destroismaisons et al. 2013). Cependant, l'une des hypothèses les plus probables implique très certainement le stress associé au réticulum endoplasmique, l'agrégation protéique et la cytotoxicité de ces agrégats cytoplasmiques (Figure 1.5) (Urushitani, Ezzi et al. 2008; Gowing 2009; Saxena, Cabuy et al. 2009; Labarre, Paré et al. 2013). Malgré la formulation de près d'une dizaine d'hypothèses toutes soutenues par des évidences scientifiques, aucun consensus n'a été établi à ce jour par la communauté scientifique quant au mécanisme d'action de la SOD1 mutée et sa toxicité (Ilieva, Polymenidou et al. 2009). Cependant, de nombreuses études effectuées chez le modèle murin permettent d'appuyer le fait qu'il s'agit bel et bien d'un gain de fonction toxique et non d'une perte de fonction. En effet, la majorité des mutations associées à la SOD1 lui permettent tout de même de conserver son activité dismutase (Borchelt, Lee et al. 1994) et la souris transgénique

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Elliott et al. 1996), contrairement aux souris transgéniques surexprimant les différentes formes de la SOD1 mutée (Bruijn, Becher et al. 1997).

De plus, bien que diverses mutations génétiques soient causatives de la toxicité de la protéine SOD1 dans certains cas de SLAF, de récentes études démontrent clairement la présence de formes de SOD1 mal repliées dans certains cas de SLAS (Bosco, Morfini et al. 2010). D'autres études suggèrent également que des modifications post-traductionnelles pourraient conférer des propriétés toxiques à la SOD1, mimant ainsi l'effet des mutations chez des patients SLAS (Ezzi, Urushitani et al. 2007; Gruzman, Wood et al. 2007; Labarre, Paré et al. 2013). Ces mutations entraineraient le mauvais repliement de la SOD1, causant son accumulation et son agrégation au sein de la cellule et conduisant ainsi à la dégénération des neurones moteurs (Bruijn, Houseweart et al. 1998; Chattopadhyay and Valentine 2009).

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Figure 1.5 Modèle de toxicité de la SOD1 impliquant son mauvais repliement et l'agrégation protéique

Dans des conditions normales, le monomère réduit (sans ion métallique) de SOD1 se dimérise avec lui-même avant l'incorporation des ions métalliques de cuivre (Cu) et de zinc (Zn). La formation de ponts disulfures intramoléculaires permet par la suite la stabilisation de l’enzyme. Le mauvais repliement de la protéine SOD1 par différents éléments favorisant la conversion des monomères réduits vers sa forme mal repliée mène à la formation de petits et de gros agrégats protéiques avec des propriétés toxiques (Tirée de (Labarre, Paré et al. 2013).

(33)

De manière intéressante, de nouvelles évidences semblent soutenir l'hypothèse d'une sécrétion de protéines SOD1 promues par les chromogranines, protéines chaperonnes abondantes dans les neurones moteurs, les interneurones et les astrocytes activés (Urushitani, Sik et al. 2006; Urushitani, Ezzi et al. 2008). La protéine mutante ainsi sécrétée pourrait alors induire la mort des neurones moteurs et une microgliose par la même occasion (Urushitani, Sik et al. 2006). L'hypothèse d'un tel mécanisme pathogénique, où la SOD1 mutante serait sécrétée, vient appuyer l'hypothèse selon laquelle la maladie n'est pas exclusivement inhérente aux neurones moteurs et qu'il y a bel et bien propagation de la toxicité d'une cellule à une autre (Clement, Nguyen et al. 2003; Grad, Guest et al. 2011; Munch, O'Brien et al. 2011; Labarre, Paré et al. 2013). Malgré ces évidences, suggérant qu'une SOD1 mutée pourrait induire le mauvais repliement d'une SOD1 wild-type (WT), le phénomène de dégénérescence spécifique aux neurones moteurs demeure un mystère.

Le mécanisme par lequel la SOD1 mutante provoque une dégénérescence sélective des neurones moteurs, sans causer la pathologie au sein de d'autres tissus ou organes, reste aussi inexpliqué. Cependant, l'idée selon laquelle la maladie ne serait pas intrinsèque aux neurones moteurs et impliquerait l'influence des autres cellules du système nerveux, telles que les microglies et les astrocytes, a récemment été davantage étudiée. En effet, des études réalisées sur des souris chimériques ont permis de démontrer qu'en présence de cellules gliales portant une mutation de la SOD1 associée à la SLA, les neurones moteurs ne portant pas de mutations développent une dégénérescence axonale importante (Clement, Nguyen et al. 2003). Ce même phénomène peut être observé lorsque des neurones moteurs sont cultivés en présence de milieu conditionné d'astrocytes et de microglies mutantes SOD1 (Di Giorgio, Carrasco et al. 2007; Marchetto, Muotri et al. 2008; Haidet-Phillips, Hester et al. 2011). Ainsi, des facteurs sécrétés par les cellules gliales contribueraient au déclenchement et au maintien de la pathologie au sein des neurones moteurs (Nagai, Re et al. 2007; Ilieva, Polymenidou et al. 2009). Par conséquent, la contribution des autres types cellulaires au développement et au maintien de la maladie semble être un élément important de la SLA (Figure

(34)

14

Figure 1.6 Contribution des différents types cellulaires au développement de la SLA

Les différents types cellulaires portant une mutation dans le gène SOD1 influencent de diverses façons l'évolution de la maladie. Les neurones moteurs accélèrent l'apparition des symptômes, les microglies et les astrocytes accélèrent la progression de la maladie, tandis que les cellules musculaires et les cellules endothéliales ne semblent pas avoir d'effet notable (Ilieva, Polymenidou et al. 2009).

1.2.2 Protéinopathie TDP-43 et FUS

Des inclusions cytoplasmiques, formées par une accumulation anormale de protéines à l’intérieure du cytoplasme des cellules, sont présentes dans de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que les maladies d'Alzheimer, d'Huntingdon et la SLA (Ross and Poirier 2004; Davidson, Raby et al. 2011). Chez un sujet sain, la protéine TDP-43 se retrouve habituellement abondamment dans le noyau et en proportion beaucoup plus faible dans le cytoplasme. Cependant, en condition pathologique, il y a délocalisation de la protéine du noyau vers le cytoplasme, causant ainsi une accumulation de TDP-43 et la formation d’inclusions cytoplasmiques (Figure 1.7) (Buratti and Baralle 2008). La présence de protéines TDP-43 dans les inclusions cytoplasmiques des tissus du système nerveux des patients, tant chez les cas familiaux que les cas sporadiques, a amené un nouvel éclairage sur les mécanismes sous-jacents de cette maladie (Neumann, Sampathu et al. 2006; Van

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Deerlin, Leverenz et al. 2008; Mackenzie, Rademakers et al. 2010). De plus, ces inclusions cytoplasmiques TDP-43 positives ont été mises en évidence par immunohistochimie dans des biopsies de peau de patients atteints de l'une ou l'autre forme de SLA (Suzuki, Mikami et al. 2010). Autre fait intéressant, des inclusions de TDP-43 cytoplasmiques sont également présentes chez les patients atteints de dégénérescence lobaire frontrotemporale (DLFT), maladie neurodégénérative entraînant une démence qui peut se développer en co-morbidité avec la SLA (Wang, Wu et al. 2008). TDP-43 agit donc comme marqueur pathologique pour ces deux maladies.

Le rôle de la protéine TDP-43 anormale n'est pas très bien caractérisé à ce jour. Cependant, de nombreuses études mettent en évidence l'implication de la protéine de type sauvage dans la stabilisation des transcrits de neurofilaments, plus particulièrement le neurofilament light chain (NFL) (Moisse, Mepham et al. 2009; Volkening, Leystra-Lantz et al. 2009). Ainsi, il serait possible que la protéine anormale entrave cette régulation, essentielle au bon fonctionnement de la cellule. Les efforts de recherche portés sur la compréhension des mécanismes impliquant la délocalisation de TDP-43 ont permis la découverte d'une autre protéine ayant des fonctions similaires : Fused in

sarcoma (FUS). Également une protéine de liaison à l'ARN, FUS possède un mécanisme de

délocalisation dégénératif très similaire à celui de TDP-43 (Mackenzie, Rademakers et al. 2010; Colombrita, Onesto et al. 2011; Pokrishevsky, Grad et al. 2012). Malgré leurs similitudes importantes, leur agrégation semble mutuellement exclusive : les cellules positives aux agrégats de TDP-43 sont négatives aux agrégats de FUS et vice versa (Kwiatkowski, Bosco et al. 2009).

(36)

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Figure 1.7 Modèle de protéinopathie de TDP-43

En condition normale, la protéine TDP-43 se trouve en quantité importante dans le noyau et en quantité très faible dans le cytoplasme. En condition pathologique, il est possible d'observer une délocalisation de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme et la présence d'inclusions ubiquitinées de protéines (Buratti and Baralle 2008).

1.2.3 Facteurs environnementaux

Le lien entre de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que le Parkinson et l'Alzheimer, et divers facteurs environnementaux a bien été établi au courant des dernières années (Jadiya and Nazir 2012; Allen and Levy 2013; Lee and Freeman 2014; Richardson, Roy et al. 2014). Plusieurs hypothèses tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLA. L'exposition aux pesticides est considérée comme un facteur de risque potentiel au développement de la maladie, tout comme l'exposition aux métaux lourds, aux nettoyants et dégraisseurs commerciaux, au sélénium et aux cétones (McGuire, Longstreth et al. 1997; Kamel, Umbach et al. 2005; Kamel, Umbach et al. 2008; Johnson and Atchison 2009; Kamel, Umbach et al. 2012; Beghi 2013). De plus, certains métiers sembleraient plus

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à risque, comme coiffeur, militaire, fermier et joueur de soccer en raison de leur exposition prolongée aux solvants et aux pesticides (Haley 2003; Armon 2004; Park, Schulte et al. 2005). Cependant, le fait d'être fumeur ou d'être exposé de façon prolongée au gaz naturel ou aux radiations ne semble pas constituer un facteur de risque environnemental de la SLA (Yu, Su et al. 2014).

1.3 Le stress associé au réticulum endoplasmique

Le réticulum endoplasmique (RE) est une organelle liée à la membrane nucléaire des cellules eucaryotes. Il reçoit de nombreux signaux cellulaires dans le but de maintenir l'homéostasie de la cellule. Chez les neurones, le RE est présent dans le corps cellulaire et est appelé corps de Nissl. Assurant des rôles multiples au sein de la cellule, le RE joue un rôle particulièrement essentiel dans la synthèse protéique, le repliement des protéines, la régulation et la réalisation des modifications post-traductionnelles (Ellgaard and Helenius 2003). Le RE possède un système de protéines chaperonnes efficace visant à prévenir l'accumulation de protéines mal repliées ou l'agrégation protéique (Horwich 2002). Différentes conditions physiologiques ou pathologiques peuvent venir perturber le processus de repliement des protéines s'effectuant dans la lumière (lumen) du RE, contribuant à l'accumulation de protéines mal repliées. Cette condition cellulaire constitue le stress du RE (Hetz, Martinon et al. 2011). Le RE comprend trois protéines membranaires jouant le rôle de senseur du stress et étant impliquées dans la réponse aux protéines mal repliées : l'inositol-requiring

enzyme 1 (Ire1), l'activating transcription factor 6 (ATF6) et la protein kinase RNA-activated (PKR)-like ER kinase (PERK) (Kraskiewicz and FitzGerald 2012)

1.3.1 La réponse aux protéines mal repliées

La réponse aux protéines mal repliées ou unfolded protein response (UPR) est un mécanisme associé au RE lorsque ce dernier est en condition de stress. Ce mécanisme est très conservé dans les différentes espèces, allant des levures aux mammifères. En condition normale, chaque senseur est lié à la glucose-regulated protein 78/B-cell immunoglobulin binding protein (GRP-78/Bip), une protéine chaperonne jouant un rôle essentiel au sein du RE (Kraskiewicz and FitzGerald 2012). En condition de stress, GRP-78/Bip ne lie plus les senseurs et la cascade de signalisation commence (Figure 1.8) (Healy, Gorman et al. 2009).

(38)

18

L'effet combiné observé par l'activation des trois branches de l'UPR, Ire1, ATF6 et PERK, résulte en une régulation à la hausse de plusieurs gènes codant pour des chaperonnes et une régulation à la baisse de la synthèse protéique (Roth and Koshland 1981; Turano, Coppari et al. 2002; Atkin, Farg et al. 2006). Les protéines chaperonnes du RE catalysent la formation et le réarrangement des ponts disulfures intra et intermoléculaires, permettant ainsi de diminuer la quantité de protéines mal repliées et par le fait même, le stress associé au RE (Roth and Koshland 1981; Turano, Coppari et al. 2002).

Ire1 est une protéine possédant une activité kinase intrinsèque et endoribonucléase. Elle est encodée chez l'humain par le gène ERN1 (Tirasophon, Welihinda et al. 1998). En condition de stress, GRP-78/Bip ne lie plus Ire1, qui s'oligomérise et active son domaine ribonucléase via l'autophosphorylation. Par la suite, Ire1 est en mesure de cliver l'ARNm de la X-box binding protein 1 (XBP1), enlevant ainsi 26 nucléotides d'un intron non conventionnel et provoquant le déplacement du cadre de lecture (Kober, Zehe et al. 2012). Cette modification à l'ARNm permet la traduction en une protéine fonctionnelle, le facteur de transcription sXBP1 (Calfon, Zeng et al. 2002; Healy, Gorman et al. 2009). La protéine sXBP1 est impliquée dans plusieurs voies de signalisation, telles que la régulation des gènes codant pour certains complexes d'histocompatibilité de classe II et la différenciation des cellules plasmatiques (Ono, Liou et al. 1991; Iwakoshi, Lee et al. 2003). En condition de stress cellulaire, sXBP1 régule à la hausse des gènes codant pour des protéines chaperonnes et des protéines impliquées dans l'endoplasmic-reticulum-associated protein

(39)

Figure 1.8 Représentation schématique des voies de signalisation initiées par les trois branches de l'UPR (Healy, Gorman et al. 2009)

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Quant à lui, ATF6 est un facteur de transcription qui, une fois libéré de GRP-78/Bip, subit un clivage protéolytique dans l'appareil de Golgi. La portion cytosolique nouvellement créée est transloquée vers le noyau, où le fragment agira à titre de facteur de transcription pour des gènes associés à des chaperonnes, tels que GRP-78/Bip et GRP-94, et des gènes associés directement à l'UPR, comme XBP1 (Li, Baumeister et al. 2000; Healy, Gorman et al. 2009).

Finalement, lorsque GRP-78/Bip ne lie plus PERK, cette dernière se dimérise et s'autophosporyle, provoquant ainsi son activation (Healy, Gorman et al. 2009). Par la suite, la PERK active peut phosphoryler la sérine 51 du facteur eIF2α, le rendant ainsi inactif (Schroder and Kaufman 2005). L'inactivation de eIF2α entraîne l'inhibition de la traduction majoritaire au sein de la cellule, soit la traduction cap-dépendante. Cependant, les ARNm n'impliquant pas ce processus de traduction, comme les ARNm contenant des Internal ribosome entry site (IRES), peuvent tout de même être traduits (Hetz, Martinon et al. 2011).

Au cours des dernières années, des études ont été réalisées dans le but d'établir un lien entre les trois branches de l'UPR et la SLA. Ces études ont démontré que des souris exprimant certaines mutations associées à la SOD1, combinées à une activation de l'UPR, développent plus rapidement les symptômes de la maladie (Wang, Popko et al. 2011). De plus, il a été démontré qu'en réduisant le stress du RE, il est possible de diminuer in vivo, dans un modèle transgénique de

Caenorhabditis elegans, la toxicité causée par les agrégats de TDP-43 (Vaccaro, Patten et al. 2013).

Une autre étude a également démontré que suite à l'administration de salubrinal, un inhibiteur du stress du RE, la survie des souris mutantes SOD1G93A est augmentée (Saxena, Cabuy et al. 2009).

Ces résultats indiquent donc le lien entre l'UPR et la SLAF, ouvrant ainsi une porte à la recherche d'un traitement agissant directement sur les facteurs du stress associé au RE.

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1.3.2 Composés connus pour induire un stress au réticulum endoplasmique 1.3.2.1 Curcuma

Le curcumin, composante majeure responsable du pigment jaune du curcuma (Curcuma longa) est couramment utilisé comme épice dans la cuisine indienne et a retenu l'attention de plusieurs spécialistes en raison de ses propriétés bénéfiques. Malgré la mise en évidence de ses propriétés antioxydantes, anti-carcinogéniques, anti-angiogéniques et anti-inflammatoires par l'intermédiaire de nombreuses études, plusieurs équipes de recherche ont également démontré que le curcuma peut induire une augmentation du stress au niveau du RE (Aggarwal, Sundaram et al. 2007; Pae, Jeong et al. 2007; Bakhshi, Weinstein et al. 2008; Cao, Li et al. 2013). En effet, une augmentation significative de GRP-78/Bip est présente suite à un traitement au curcuma de cellules pulmonaires et immunitaires cancéreuses (Pae, Jeong et al. 2007; Lin, Huang et al. 2008). Le curcuma semblerait augmenter le stress au niveau du RE en stimulant la production d'espèces réactives d'oxygène (ROS) (Minamino, Komuro et al. 2010; Pal, Cristan et al. 2010).

1.3.2.2 Paraquat

Le paraquat est un pesticide à effet herbicide largement utilisé à travers le monde, malgré son utilisation de plus en plus restreinte voire interdite dans certains pays (Wunnapuk, Mohammed et al. 2014). Son ingestion cause des lésions dégénératives aigües du système nerveux. Le paraquat possède des effets neurotoxiques similaires à ceux du plomb et du mercure (Dinis-Oliveira, Duarte et al. 2008; Gawarammana and Buckley 2011). Plusieurs équipes de recherche ont démontré que le paraquat reproduit plusieurs symptômes associés à des maladies neurodégénératives, comme la perte des neurones dopaminergiques, une déficience en dopamine, une augmentation du stress oxydatif, un mauvais fonctionnement du protéasome et des dysfonctions motrices (Liou, Chen et al. 1996; Brooks, Chadwick et al. 1999; McCormack, Atienza et al. 2005; Kuter, Smialowska et al. 2007; Yang, Tiffany-Castiglioni et al. 2009). De récentes évidences démontrent également que le paraquat activerait la voie Ire1 de l'UPR, déclenchant ainsi une cascade de signalisation menant très souvent à l'apoptose de la cellule (Yang, Tiffany-Castiglioni et al. 2009). De plus, il est possible d'observer une augmentation significative de GRP-78/Bip suite à un traitement au paraquat chez des lignées de neurones moteurs et de neuroblastomes humains et murins (Yang and Tiffany-Castiglioni 2007).

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1.3.2.3 Tunicamycine

La tunicamycine est un antibiotique inhibant la N-acétylglucosamine phototransférase (GTP) via l'inhibition de la N-glycolysation, ce qui a pour effet de bloquer la synthèse des oligosaccharides liés aux lipides dans le RE (Banerjee, Lang et al. 2011). Ainsi, la formation des glycoprotéines n'est pas possible, ce qui cause une accumulation de glycoprotéines non repliées et par le fait même un stress au niveau du RE (Kornfeld and Kornfeld 1985; Banerjee, Lang et al. 2011). De plus, un traitement à la tunicamycine induit l'arrêt du cycle cellulaire en G1, en plus d'entraîner éventuellement l'apoptose des cellules (Banerjee, Lang et al. 2011; Schonthal 2012).

1.3.2.4 Rapamycine

La rapamycine, ou sirolimus, est un immunosupresseur inhibant l'activation des cellules T et qui est essentiellement utilisé dans les cas de transplantation rénale (Sehgal, Baker et al. 1975; Thomson, Turnquist et al. 2009; Staats, Hernandez et al. 2013). Ce composé est très utilisé en recherche fondamentale dans le but d'augmenter l'autophagie via la phosphorylation du récepteur mammalian

target of rapamycin (mTOR) (Heitman, Movva et al. 1991; Staats, Hernandez et al. 2013). Bien que

plusieurs études indiquent que la rapamycine a un effet bénéfique sur plusieurs maladies neurodégénératives, telles que l'Alzheimer et le Parkinson, en raison de son effet pro-autophagique, plusieurs études ont également été menées en lien avec la SLA (Spencer, Potkar et al. 2009). De manière intéressante, les souris traitées à la rapamycine ont vu leur survie diminuée ou inchangée (Bhattacharya, Bokov et al. 2012; Staats, Hernandez et al. 2013). Malgré ses effets bénéfiques sur le stress du RE en raison de l'autophagie, un traitement prolongé et intensif à la rapamycine induirait ce dernier de façon importante (Ching and Weihl 2013).

1.4 Les modèles animaux de la SLA

Les efforts de recherche afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à la SLA, tant familiale que sporadique, sont très importants en raison de la gravité de la maladie et de l'incapacité de la médecine moderne à traiter de manière efficace et permanente les patients. Afin d'étudier les différents gènes impliqués dans la SLAF et l'implication des différentes mutations qui les affectent, de nombreux modèles animaux ont été développés. En effet, des modèles transgéniques chez la drosophile (Drosophila melanogaster), le nématode (Caenorhabditis elegans), le poisson zèbre

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(Danio rerio) et la souris (Mus musculus) sont fréquemment utilisés en laboratoire (Julien and Kriz 2006; Harvey, Richie et al. 2011; Berthod and Gros-Louis 2012).

Plusieurs modèles murins transgéniques, surexprimant certaines des mutations géniques associées à la SLAF, ont déjà été générés et sont disponibles sur le marché pour l'étude de la SLA. Les deux types de souris transgéniques les plus fréquemment utilisés sont les souris SOD1 mutantes et TDP-43 mutantes. Les souris transgéniques SOD1 présentent, de façon analogue à la pathologie humaine, des symptômes très caractéristiques : dégénérescence sélective des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière, astrocytose et microgliose des tissus atteints et pertes d'axones myélinisées se situant dans la corne ventrale de la moelle épinière, provoquant ainsi un important déficit moteur et une atrophie des muscles (Gurney, Pu et al. 1994; Wong, Pardo et al. 1995; Reaume, Elliott et al. 1996; Bruijn, Becher et al. 1997; Bruijn, Houseweart et al. 1998; Alexander, Erwin et al. 2004). Malgré ces similitudes au niveau des symptômes, plusieurs facteurs diffèrent de manière draconienne, tels que le moment d’apparition des premiers symptômes, la progression et la sévérité de la maladie pour les souris surexprimant des mutations différentes (Tableau 1.2). À ce jour, aucun lien entre ces différences et la stabilité des formes de la SOD1 ou son activité enzymatique, très certainement influencée par la nature de la mutation, n'a été établi. Près d'une quinzaine de souris portant des mutations différentes ont été générées depuis la découverte du lien entre la SLA et la SOD1, mais certains mutants restent plus utilisés que d'autres en raison de l'accumulation importante de protéines et/ou d'apparition des symptômes plus rapide (Tableau

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Tableau 1.2 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLAF

(Labarre, Paré et al. 2013)

Plusieurs modèles de souris transgéniques TDP-43 ont été développés mais avec plus de difficulté. En effet, les premières souris TDP-43 ont été générées à partir de l'ADN complémentaire (ADNc) du

gène TARDBP humain. Ces souris surexpriment de manière très importante le transgène et présente une apparition précoce des symptômes (Wegorzewska, Bell et al. 2009; Wijesekera and Leigh 2009; Stallings, Puttaparthi et al. 2010; Wils, Kleinberger et al. 2010). Malgré le phénotype sévère de la maladie, ces souris transgéniques ne possèdent que quelques-unes des caractéristiques retrouvées chez les patients, excluant la présence d'agrégats protéiques de TDP-43, remettant en cause la pertinence du modèle (Janssens, Kleinberger et al. 2011; Swarup and Julien 2011). Cependant, les efforts de recherche déployés ont permis de générer un modèle transgénique beaucoup plus représentatif pour l'étude de la SLA. En effet, un modèle murin a été développé en microinjectant la séquence génomique du gène incluant un domaine d'autorégulation dans la partie 3' non transduite du gène. Ce domaine d'autorégulation permet une expression plus modérée du transgène, soit 3 à 4 fois, permettant ainsi un phénotype moins sévère (Swarup, Phaneuf et al. 2011). De plus, des souris TDP-43 knockout (KO) ont également été générées, mais la mutation s'avère létale pour l'embryon (Wu, Cheng et al. 2010). Plus récemment, des souris transgéniques FUS ont été générées, permettant ainsi l'étude des FUSopathies (Shelkovnikova, Peters et al. 2013).

Lors d'analyse post-mortem, les tissus des souris transgéniques SOD1, TDP-43 et même FUS présentent une augmentation des marqueurs liés au stress du RE et à UPR, corrélant ainsi avec ce

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qui est trouvé chez les patients et indiquant le lien important entre les inclusions cytoplasmiques de protéines et le stress associé au RE (Walker and Atkin 2011; Walker, Soo et al. 2013).

Le modèle du nématode, des plus intéressants en raison de la simplicité de son système neuronal et de son temps de reproduction très court, montre plusieurs avantages pour étudier l'effet d'un gène sur le système nerveux et pour identifier des composés potentiellement intéressants dans la recherche d'un traitement à la maladie (Vaccaro, Patten et al. 2012; Vaccaro, Patten et al. 2013). Le modèle de poisson zèbre est tout indiqué dans l'étude des déficits moteurs associés à la SLA. Il s'agit d'un modèle très intéressant en raison de sa transparence, permettant ainsi de visualiser les neurones moteurs et leur dégénérescence si ces derniers sont fluorescents. De nombreux variants génétiques associés aux différents mutants retrouvés dans les cas de SLAF ont été générés pour ces deux modèles (Gros-Louis, Kriz et al. 2008; Li and Le 2013; Patten, Armstrong et al. 2014; Therrien and Parker 2014). Bien que ces modèles soient moins complexes que le modèle murin et plus loin de l'humain, ils demeurent essentiels dans la recherche fondamentale.

1.5 Immunothérapie

Considérant que la SLA ne soit pas une maladie auto-immune, comme la sclérose en plaques, plusieurs études réalisées avec des modèles murins mettent en évidence le rôle du système immunitaire dans la pathogénèse de la maladie et le processus de dégénération (Hall, Oostveen et al. 1998; Alexianu, Kozovska et al. 2001; Beers, Henkel et al. 2006; Boillee, Yamanaka et al. 2006). Le système immunitaire pourrait être modulé dans le but d'avoir une réponse bénéfique à certains évènements. Ainsi, l'activation du système immunitaire via des approches d’immunisation semble des plus intéressantes comme avenues thérapeutiques dans la SLA. En effet, les formes de la SOD1 pourraient être une cible de choix dans l'immunothérapie. De récentes études démontrent qu'il est possible de détecter ces formes mal repliées via l'utilisation d'anticorps spécifiques au sein d'agrégats protéiques, tant chez les cas de SLAF que SLAS (Bosco, Morfini et al. 2010). Cette découverte majeure constitue un élément important dans la recherche sur la SLA et permet de faire un lien entre les cas familiaux et sporadiques, supportant ainsi l'hypothèse d'un mécanisme pathogénique commun.

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La découverte du mécanisme pathogénique de la SOD1 impliquant la toxicité de la SOD1 mal repliée sécrétée a permis le développement de stratégies immunologiques visant à réduire le formation d'agrégats protéiques néfastes pour la cellule (Urushitani, Sik et al. 2006). Des protocoles utilisant l'une ou l'autre des approches d'immunisation, soit l'immunisation active, se caractérisant par l'injection d'antigènes, et l'immunisation passive, se caractérisant par l'injection de sérum contenant des anticorps spécifiques, ont été testés et ont obtenu des résultats bénéfiques sur l'accumulation de la SOD1 mal repliée chez le modèle murin, prolongeant ainsi la survie des souris et retardant l'apparition des symptômes (Urushitani, Ezzi et al. 2007; Gros-Louis, Soucy et al. 2010; Takeuchi, Fujiwara et al. 2010; Liu, Tjostheim et al. 2012; Labarre, Paré et al. 2013). Ces résultats positifs confèrent donc aux anticorps spécifiques aux formes mal repliées de la SOD1 le statut d'outil moléculaire unique permettant l'étude des mécanismes pathogéniques associés à la SOD1 et ouvrent la porte à l'immunothérapie comme traitement de la maladie. Pour des informations plus détaillées sur l'immunothérapie, se référer au chapitre 3, qui est composé d'un article de revue sur le sujet.

1.6 Problématique et hypothèses de travail

Bien que de nombreux modèles animaux et cellulaires soient fréquemment utilisés dans le but d'étudier les mécanismes sous-jacents de la SLA, ces modèles permettent uniquement l'étude de la forme familiale de la SLA. C'est pourquoi le développement de nouveaux modèles d'étude, tant animaux que cellulaires, pour étudier la SLAS est urgent, puisque les patients atteints de SLAS représentent la vaste majorité des cas.

À ce jour et malgré tous les efforts de recherche déployés dans l'étude de la SLA, il n'existe aucun médicament ou biomarqueur de la progression de la maladie efficace et reconnu par la communauté scientifique et les autorités médicales. À la lumière des plus récentes avancées dans le domaine, l'hypothèse la plus plausible est que la toxicité de la protéine SOD1 mutante serait en lien avec son mauvais repliement tertiaire (Gros-Louis 2009; Labarre, Paré et al. 2013). Cette hypothèse est entièrement compatible avec les mutations dans le gène SOD1 et le gain de fonction toxique qui y est associé suggérant ainsi que le mauvais repliement de la protéine, causé par des mutations génétiques ou des modifications post-traductionnelles, pourrait être à l'origine d'une toxicité associée

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à cette protéine changée. Cette hypothèse soutient donc qu'il y aurait un lien plausible entre les formes de SLAF et SLAS et que ces formes pourraient partager une voie pathogénique commune impliquant le mauvais repliement de la SOD1. De plus, les inclusions cytoplasmiques de protéines TDP-43 sont retrouvées tant chez les patients atteints de SLAF que de SLAS, essentiellement au niveau des cellules neuronales du cerveau et de la moelle épinière. De manière similaire au lien plausible entre le mauvais repliement de la protéine SOD1 et les différents cas de SLA, nous croyons qu'une voie pathogénique commune pourrait être partagée et qu'il serait possible d'induire la formation de telles inclusions dans des cellules non pathologiques.

De plus, de nombreuses études récentes suggèrent que des perturbations au niveau du RE pourraient contribuer à l'agrégation et l'accumulation de protéines mal repliées, en raison de son rôle fondamental dans le processus de repliement des protéines. Ainsi, le stress associé au RE pourrait être impliqué dans la cascade pathogénique de la SLA. Dans cette optique, l'hypothèse principale du projet présenté au chapitre 2 est que les cas sporadiques pourraient partager avec les cas familiaux une voie pathogénique commune impliquant le mauvais repliement de la protéine SOD1, la délocalisation de TDP-43 et le stress associé au RE.

Les chapitres 3 et 4 traitent plus en profondeur du développement d'une immunothérapie comme traitement de la SLA, en lien avec les formes mal repliées de la protéine SOD1. Depuis les dernières années, de nombreux anticorps ont été développés chez le modèle murin dans le but de moduler la conformation de la SOD1 et de nombreux effets bénéfiques ou neutres sur la progression de la maladie y ont été associés. Notre hypothèse de recherche est qu'il est possible de développer une immunothérapie optimale chez le modèle murin en développant des anticorps ciblant un acide aminé clé dans la conformation de la protéine SOD1. Ainsi, le développement d'un anticorps anti-SOD1 ciblant la cystéine 111, acide aminé crucial dans la stabilité des ponts disulfures de la SOD1, semblait le choix tout indiqué pour développer cet anticorps optimal.

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Chapitre 2 : Des inclusions cytoplasmiques de

TDP-43 sont détectés dans les neurones moteurs

murins NSC-34 traités au curcuma

TDP-43 cytoplasmic inclusions detected in curcumin-treated NSC-34

motor neurons like cells

Audrey Labarre, Lydia Touzel Deschênes et François Gros-Louis

Article à soumettre dans Canadian Journal of Neurological Sciences

en décembre 2014

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2.1 Résumé

Contexte : La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par la dégénérescence sélective des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière. À l'heure actuelle, plusieurs gènes ont été identifiés comme étant impliqués dans la forme familiale de SLA, soit SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, et C9ORF72. Cependant, pour la grande majorité des cas, les causes demeurent inconnues. Plusieurs hypothèses soutiennent que le stress associé au réticulum endoplasmique (RE) pourrait jouer un rôle clé dans la pathogénèse de la maladie. Objectifs : Déterminer l'effet du stress du RE sur l'accumulation cytoplasmique de la SOD1 mal repliée et de TDP-43. Méthode : Des neurones moteurs NSC-34 ont été traités au curcuma, connu pour induire un stress au RE. Des immunobuvardages de type Western et des immunofluorescence indirectes ont été réalisés pour visualiser, localiser et quantifier les marqueurs de stress du RE, TDP-43 et SOD1. Résultats : Les cellules traitées au curcuma ont un taux de mortalité plus élevé que les contrôles et ce même à très faible concentration. Le traitement au curcuma induit une augmentation de l'expression de la chaperonne du RE GRP78/BiP. De plus, suite au traitement, une accumulation cytoplasmique de TDP-43 est observée par immunobuvardage et immunofluorescence. Conclusions : Le développement d'un modèle in vitro pour l'étude du lien entre le stress du RE et l'accumulation cytoplasmique de TDP-43 nous permettra d'avoir de nouvelles connaissances sur la pathogénèse de la SLA et pourrait mener à l'identification de causes encore inconnues.

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2.2 Abstract

Background: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult onset neurodegenerative disease characterized by the loss of motor neurons in the brain and in the spinal cord. To date, a number of genes have been discovered as causative for the classical adult onset form of familial ALS with typical symptoms, namely SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, and C9ORF72. For the vast majority of cases, the causes remain unknown. It has been repeatedly proposed, but never fully understood, that endoplasmic reticulum (ER) stress response might exert a critical role in the disease pathogenesis. Objectives: The aim of this study is to determine the effect of ER stress on the cytoplasmic accumulation of misfolded SOD1 and TDP-43. Methods: We treated NSC-34 motorneuron-like cells with curcumin known to induce ER stress. Western blotting and indirect immunofluorescence analysis were used to visualize and quantify ER stress markers, TDP-43 and SOD1 protein expression and localisation. Results: Cells treated with curcumin had inexorably a higher mortality rate than the controls even at low concentration. Curcumin treatment induced an increase the ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP expression. Furthermore, an increase of cytoplasmic TDP-43 accumulation was observed, following treatment with curcumin, by Western blot and immunofluorescence. Conclusions: The development of an in vitro cellular model to study this the link between ER stress and TDP-43 cytoplasmic deposits will bring new insights into the disease pathogenesis and may lead to the identification of yet unknown underlying mechanisms in SALS.

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2.3 Introduction

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also known as Lou Gehrig's disease, is an adult onset neurodegenerative disease characterized by the loss of upper and lower motor neurons in the brain and in the spinal cord. It is the most common motor neuron disorder and symptoms include muscle weakness leading to atrophy, dysphagia and dysarthria (Tandan and Bradley 1985). The death occurs generally within 3 to 5 years after the initial diagnosis. The only approved therapeutic agent, proven to modestly prolongs median survival by about 2 to 3 months in a fraction of ALS patients, is Riluzole (Mulder, Kurland et al. 1986; Lacomblez, Bensimon et al. 1996; Gordon 2013). About 10% of ALS patients are associated with a genetic cause and are classified as familial ALS (FALS). Though most cases of ALS are sporadic, 10% of cases have affected relatives, some with clear Mendelian inheritance and high penetrance (Gros-Louis, Gaspar et al. 2006). To date, a number of genes have been discovered as causative for the classical adult onset form of familial ALS with typical symptoms, namely SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, and C9ORF72 (Rosen, Siddique et al. 1993; Kabashi, Valdmanis et al. 2008; Sreedharan, Blair et al. 2008; Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance, Rogelj et al. 2009; Millecamps, Salachas et al. 2010; DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Due to the complexity of ALS, the underlying mechanisms of the disease are not yet fully understand. Several research groups around the world are now trying to elucidate the physiological and pathophysiological functions of the proteins encoded by these genes and its relevance to ALS.

Many neurodegenerative disorders, including ALS, are characterized by aberrant folding of proteins leading to the intracellular and extracellular accumulation of insoluble misfolded proteins. The mechanism whereby mutant SOD1 causes specific degeneration of motor neurons remains unclear. The favoured hypothesis at this time is that toxicity of SOD1 mutants is related to the misfolding and aggregation of SOD1 species (Gros-Louis, Soucy et al. 2010). Researchers have also identified ubiquitinated TDP-43 inclusions in the cytoplasm of motor neurons within the central nervous system in post-mortem tissues, a pathological hallmark now commonly found in the majority of FALS cases with or without TARDBP mutations, and in SALS cases (Neumann, Sampathu et al. 2006; Van Deerlin, Leverenz et al. 2008; Mackenzie, Rademakers et al. 2010). In healthy motor neurons, TDP-43 is typically localized to the nucleus.

Figure

Figure 1.1 Le système moteur humain et son implication dans la SLA
Figure 1.2 Représentation tridimensionnelle de la SOD1
Tableau 1.1 Principaux loci et gènes mutés identifiés chez les patients atteints de SLAF
Figure 1.3 Mutations de la SOD1 en lien avec la SLAF
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