2.5 Fonctionnalisation des nanocristaux
2.5.1 Marquage fluorescent
Le marquage fluorescent d’objets biologiques par des fluorophores est une méthode d’analyse courante en biologie et en biotechnologie (biopuces, imagerie cellulaire, analyse d’échantillon ...). De manière standard, des fluorophores organiques sont utilisés. Ils pré- sentent cependant certains inconvénients : principalement une faible tenue sous excitation lumineuse (photoblanchiment) et une bande d’absorption étroite, ce qui oblige à utiliser plusieurs sources d’excitation lors d’un marquage par divers fluorophores. Les nanocristaux présentent au contraire une bande d’absorption large, ce qui permet d’utiliser une seule source lumineuse pour exciter des nanocristaux émettant à différentes longueurs d’onde. Ils sont aussi très résistants au photoblanchiment sur des durées allant jusqu’à plusieurs heures alors que les fluorophores organiques ne durent que quelques minutes au mieux [58], [59]. De plus, le spectre de PL des nanocristaux est symétrique par rapport au maximum d’intensité et étroit (∆λ ≈ 30 nm), ce qui n’est pas le cas pour la majorité des colorants organiques (exemple de la rhodamine 6G et du sulfate de quinine sur la figure 3.13). La forme du spectre de PL des nanocristaux permet une meilleure différenciation des signaux collectés lors du marquage de plusieurs objets par divers fluorophores.
Le principal obstacle à leur utilisation en biologie est leur incompatibilité en sortie de synthèse avec le milieu biologique. Le but de cette étude est de résoudre ce problème tout en préservant les propriétés optiques des nanocristaux.
2.5. FONCTIONNALISATION DES NANOCRISTAUX 53 Dispersion en milieu aqueux
Les applications liées à l’introduction de nanocristaux dans un milieu biologique re- quièrent leur dissolution en milieu aqueux. Pour cela, on remplace les ligands TOPO par des ligands bifonctionnels, composés de trois parties X-Y-Z [60]. X est la fonction d’ancrage qui permet la liaison du ligand avec le nanocristal, Y est un bras espaceur (chaîne alkyle, éthoxy . . . ) et Z une fonction chimique.
Nous avons essayé plusieurs types de ligands, tous possédant pour fonction d’ancrage un groupe thiol (-SH) couramment utilisé sur les nanocristaux CdSe(ZnS) [58], [60]. Les fonc- tions Z qui servent à solubiliser les nanocristaux en milieu aqueux sont les fonctions amine (-NH2) [60], sulfonique (-SO3H), phosphonique (-PO(OH)2), carboxylique (-COOH) [58] et hydroxyle (-OH) [59]. Notre choix s’est d’abord porté sur l’acide 1-mercaptoundécanoïque (MUA), HS-(CH)10-COOH, appartenant à une famille de ligands largement utilisés pour ces applications [58], [61]. Puis, nous avons comparé deux ligands similaires du point de vue de leurs fonctions mais dont le bras espaceur change : le 1-mercaptohexanol, HS-(CH)6-OH et un dérivé du diéthylèneglycol où l’un des groupements alcools est substitué par un groupe thiol, HS-(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2-OH.
1 - Fonctionnalisation par une fonction carboxyle (MUA)
Nous avons étudié particulièrement l’effet de la croissance d’une coquille avant l’étape d’échange des ligands. Pour cela, des nanocristaux cœur CdSe de diamètre de 3,6 nm, ainsi que les mêmes cœurs recouverts d’une coquille ZnSe ont été fonctionnalisés.
L’échange s’effectue sur 20 mg de nanocristaux dispersés dans une solution contenant 200 mg de MUA dans 4 mL de 1,4-dioxane. Après 12 h d’agitation, le précipité est centri- fugé, puis lavé deux fois à l’eau. Enfin, on redisperse les nanocristaux recouverts de MUA, après déprotonation de la fonction carboxyle par de l’ammoniaque (NH4OH), dans de l’eau déminéralisée [43].
Fig. 2.12 – Spectres a) d’absorption et b) de photoluminescence de solutions de même concentration en nanocristaux CdSe et CdSe(ZnSe), obtenus dans les mêmes conditions d’excitation, avant (ligne en pointillé, dispersion dans du toluène) et après (ligne pleine, dispersion en solution aqueuse) la fonctionnalisation par le MUA. Les spectres de photolu- minescence des nanocristaux CdSe ont été multipliés par 2 et 20 pour les distinguer.
spectroscopie infra-rouge [43]. Une faible fraction de TOPO est cependant visible, l’échange n’est donc pas complet. La figure 2.12.a montre que pour les nanocristaux cœur ainsi que pour les nanocristaux cœur(coquille), les spectres d’absorption ne sont pas modifiés par l’échange de ligands et la dispersion en solution aqueuse. En revanche, l’efficacité de PL des nanocristaux cœur est considérablement réduite en milieu aqueux (Fig. 2.12.b), alors que celle des nanocristaux cœur(coquille) est pratiquement inchangée. On attribue ce déclin de l’intensité de PL, pour les cœurs, à une passivation moins importante de la surface par les ligands MUA en comparaison des ligands TOPO. Le fait que le spectre de PL du système cœur(coquille) reste inchangé du point de vue de la position du pic, de la valeur de ∆λ et de l’intensité, prouve que lorsque la coquille est présente, le cœur n’est pas très sensible au degré de passivation de la surface extérieure du nanocristal. La coquille de ZnSe a donc joué son rôle de barrière protectrice, passivant efficacement le cœur quel que soit l’environnement du nanocristal.
La dispersion de nanocristaux cœur(coquille) en milieu aqueux, en gardant de bonnes propriétés optiques, est donc possible grâce à la fonctionnalisation par des ligands MUA. Ces ligands présentent cependant deux inconvénients : les nanocristaux doivent être maintenus dans une solution légèrement basique pour déprotoner le MUA, et la fonction carboxylate a tendance à interagir de façon non-spécifique avec d’autres molécules biologiques, à cause de la charge négative présente à son extrémité (interactions électrostatiques).
Nous avons cherché d’autres ligands dans le but d’obtenir une sensibilité moindre au pH et une plus grande spécificité par d’autres types d’interactions chimiques en vue d’utiliser ces ligands dans un processus de greffage sur des molécules biologiques.
2 - Fonctionnalisation par une fonction hydroxyle
Parmi les fonctions non chargées permettant une dissolution en milieu aqueux, on trouve la fonction hydroxyle (-OH). La première tentative avec le mercapto-1-hexanol ne fût pas très concluante, car si l’échange de ligands par la même méthode que précédemment est efficace, la dissolution en milieu aqueux n’est pas satisfaisante. En effet, ces nanocristaux fonctionnalisés se dispersent dans des alcools mais pas dans l’eau.
Afin d’augmenter l’interaction avec le milieu polaire, les chimistes du " Laboratoire d’ Électronique Moléculaire Organique et Hybride " du CEA ont synthétisé un ligand qui possède des groupes éther le long de la chaîne alkyle : le 8-thio-3,6-dioxaoctanol (1) (Fig. 2.14.c). La synthèse de ce ligand est détaillée dans la référence [62]. L’échange se fait de la même façon que précédemment ; les nanocristaux obtenus peuvent être dispersés, sans qu’ils précipitent, dans de l’eau dont le pH est compris entre 5 et 9.
Des mesures d’absorption et de PL ont été effectuées avant et après la fonctionnalisation avec le ligand 1. La figure 2.13.a montre que le spectre d’absorption reste inchangé en ce qui concerne le pic excitonique. La forme du spectre de PL (Fig. 2.13.b) reste la même, en particulier la valeur de ∆λ est identique. En revanche, le rendement quantique des nano- cristaux diminue d’un facteur 200 environ, ce qui reste tout de même suffisant, comme nous le verrons par la suite, pour les expériences de marquages en biologie. Une des raisons qui peut expliquer cette diminution est la présence de molécules d’eau proche de la surface du nanocristal. En effet, après fonctionnalisation, des atomes d’oxygène qui attirent ces molé- cules se retrouvent à proximité de la surface par l’intermédiaire du ligand 1. Nous pensons pouvoir améliorer le RQF des nanocristaux fonctionnalisés en utilisant des nanocristaux doubles coquilles, ces derniers étant mieux isolés de leur environnement (cf. § 2.4.1).
De plus, les solutions sont stables sous forme colloïdale et gardent leurs propriétés op- tiques pendant plusieurs mois dans des solutions tampons, couramment utilisées par les
2.5. FONCTIONNALISATION DES NANOCRISTAUX 55
Fig. 2.13 – Spectres a) d’absorption et b) de photoluminescence de solutions de même concentration en nanocristaux CdSe(ZnSe), obtenus dans les mêmes conditions d’excitation, avant (ligne en pointillé, dispersion dans du chloroforme) et après (ligne pleine, dispersion en solution aqueuse) la fonctionnalisation le ligand 1.
8-thio-3,6-dioxaoctanol : ligand 1
c)
Nanocristal
Ancrage Bras espaceur Biotine Streptavidine Biotine Molécule biologique
a)
CdSe ZnSe 95% 5% Biotine Ligand 2 Ligand 1 Hydroxyleb)
OH O O O H O O SH S NH N H N H O O O O O N H SH Od)
Ligand 2Fig. 2.14 – a) Greffage d’un nanocristal sur une molécule biologique par l’interaction forte et spécifique biotine/streptavidine. b) Représentation d’un nanocristal fonctionnalisé pour la solubilisation en milieu aqueux et pour le greffage. c) Représentation chimique du ligand 1. d) Représentation chimique du ligand 2.
biologistes.
Cette approche nous a permis d’obtenir des nanocristaux solubles dans l’eau, avec des dispersions stables dans le temps. La large gamme de pH obtenue est un avantage décisif par rapport à d’autres méthodes. Le groupe hydroxyle minimise les interactions électrostatiques avec d’autres molécules (interactions non spécifiques) mais ne permet pas de former un lien chimique avec une biomolécule (greffage).
Greffage de nanocristaux sur des molécules biologiques
Le greffage des nanocristaux sur des molécules biologiques nécessite une reconnaissance entre cette dernière et le nanocristal fonctionnalisé. Pour cela, un ligand (2) composé d’une fonction d’ancrage thiol, d’une longue chaîne alkyle incluant des groupements éther et d’une extrémité biotinilée a été synthétisé [62] (Fig. 2.14.d). La molécule de biotine se lie avec les molécules biologiques par l’intermédiaire d’une interaction forte et spécifique avec la streptavidine (formation d’un complexe) (Fig. 2.14.a). Ce type d’interaction est couramment utilisée par les biologistes [59], [61], [63].
La fonctionnalisation par le ligand 2 pour le greffage ne permet pas la dispersion des nanocristaux dans l’eau. Il faut combiner cette approche avec la méthode de solubilisation précédente. Nous avons fonctionnalisé des nanocristaux CdSe(ZnSe) synthétisés par la mé- thode décrite précédemment, avec 5 % molaire de ligand 2 et 95 % de ligand 1 [62]. Ainsi, la solubilité dans l’eau n’est pas affectée. Le ligand 1 forme une couche compacte autour du nanocristal, de laquelle émerge la biotine en raison de son bras espaceur nettement plus long que celui du ligand 1 (Fig. 2.14.b). Des mesures d’absorption et de PL réalisées sur ces nanocristaux fonctionnalisés montrent qu’ils gardent les mêmes propriétés optiques qu’avec le ligand 1 seul (Fig. 2.13).
Les premiers marquages de cellules biologiques ont été réalisés avec ces nanocristaux au laboratoire " Canaux Ioniques et Signalisation " du CEA. Un échantillon témoin est marqué par un fluorophore organique, l’Alexa-488. Le protocole est décrit par la référence [62]. La figure 2.15 présente des images obtenues au microscope de fluorescence sur des cultures de cellules nerveuses marquées par des nanocristaux fonctionnalisés, comme expliqué ci-dessus et par l’Alexa-488. La comparaison de ces deux images montre un marquage identique, ce qui prouve l’interaction spécifique des nanocristaux avec les cellules nerveuses.
Fig. 2.15 – Images obtenues au microscope de fluorescence sur des cultures de cellules nerveuses marquées a) par des nanocristaux fonctionnalisés biotine et b) par l’Alexa-488.
2.5. FONCTIONNALISATION DES NANOCRISTAUX 57 Le greffage de nanocristaux sur des biomolécules est très prometteur. Ils peuvent être employés comme sonde passive, révélant une structure cellulaire. C’est le cas du marquage fluorescent dont les exemples se sont multipliés ces dernières années, tant pour le marquage in vitro [58], [64], [65], [63], [66] que in vivo [67]. D’autres applications sont également envisagées en les utilisant comme sonde active, par exemple pour déclencher un signal nerveux par excitation lumineuse de nanocristaux fixés en surface de neurones [61].