3.2 Méthodologie
3.2.1 Maintenance des xénopes
3.2.1.1 Conditions de maintenance des xénopes ... 145
3.2.1.2 Exposition des xénopes F0 ... 147
3.2.2 Suivi de la croissance des xénopes F0 ... 148
3.2.3 Étude de la transcription des gènes hépatiques des femelles F0 ... 149
3.2.4 Analyses phénotypiques des xénopes femelles F0 ... 153
3.2.4.1 Mesure de la glycémie ... 153
3.2.4.2 Test de tolérance au glucose ... 153
3.2.4.3 Mesure de l’activité de l'alanine aminotransférase sérique ... 154
3.2.4.4 Calcul du rapport hépato-somatique ... 154
3.2.4.5 Colorations histologiques du foie par HE et ORO ... 154
3.2.4.6 Capacité oxydative et production mitochondriale de ROS ... 155
3.2.5 Age à la maturité sexuelle et reproduction des xénopes F0 ... 159
3.2.6 Suivi du développement et de la croissance des xénopes F1 ... 161
3.2.7 Validations statistiques ... 161
3.3 Résultats ... 162
3.3.1 Mesures des concentrations réelles dans les milieux d’exposition ... 162
3.3.2 Effets sur le développement et la croissance des xénopes F0 ... 163
3.3.2.1 Sur les malformations et la mortalité ... 163
3.3.2.2 Sur la métamorphose ... 164
3.3.3 Effets sur le profil transcriptionnel hépatique des femelles F0 ... 166
3.3.4 Effets sur certains paramètres physiologiques des femelles F0 ... 179
3.3.4.1 Perturbation du métabolisme hépatique ... 179
3.3.4.2 Hépatotoxicité ... 183
3.3.5 Effets sur la maturité sexuelle et la reproduction des xénopes F0 ... 184
3.3.1 Effets sur le développement et la croissance des xénopes F1 ... 186
3.4 Discussion... 190
3.4.1 Effets sur la croissance et la métamorphose des têtards exposés ... 190
3.4.1.1 Survie ... 190
3.4.1.2 Malformations ... 191
3.4.1.3 Métamorphose ... 191
3.4.2 Effets métaboliques sur les femelles adultes exposés ... 193
3.4.2.1 Hypertrophie hépatique ... 193
3.4.2.2 Stéatose hépatique ... 193
3.4.2.3 Hépatotoxicité ... 195
3.4.2.4 Stimulation de l’activité mitochondriale ... 195
3.4.2.5 Modification de la transcription des défenses antioxydantes ... 196
3.4.2.6 Perturbation du métabolisme glucidique ... 197
3.4.2.7 Phénotype semblable à une stéatopathie non alcoolique ... 198
3.4.3 Effets sur la reproduction des parents et sur la descendance ... 199
3.4.3.1 Perturbation du comportement reproducteur des parents ... 199
3.4.3.2 Retard de la métamorphose de la descendance ... 200
3.4.3.3 Modification morphologique de la descendance ... 201
3.1 Objectif de l’étude et approche expérimentale
Cette partie de nos travaux a pour but d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les
perturbations physiologiques induites par une exposition chronique aux perturbateurs
endocriniens, benzo[a]pyrène et triclosan. Nous nous sommes également intéressés aux
effets multigénérationnels de ces deux molécules. L’étude multigénérationnelle des effets de
la contamination par les perturbateurs endocriniens dans l’eau d’élevage a été conduite
suivant une approche considérant des individus exposés tout au long de leur vie (génération
F0) mais également leur progéniture non exposée (génération F1). Comme dans nos travaux
précédents, nous avons adopté une démarche intégrative associant l’étude de données
moléculaires, métaboliques et phénotypiques.
L’ensemble de nos analyses a été effectué sur la base d’une population de
Xenopus tropicalis témoin et trois populations de xénopes exposées dès les premiers jours de
leur vie à 50 ng.L
-1de benzo[a]pyrène, de triclosan ou d’un mélange benzo[a]pyrène/triclosan
(génération F0, Figure 3.1.A). Ces concentrations sont couramment retrouvées dans les eaux
de surface (Lindström et al., 2002; Wind et al., 2004; Gasperi et al., 2009; Wu et al., 2011). Pour
approfondir la compréhension des effets de ces molécules sur les traits d’histoire de vie des
xénopes, les paramètres suivants ont été étudiés : l’apparition de malformations et la mortalité
au cours de leur croissance (Figure 3.1.A.
①et
②), l’âge, la taille et la masse des individus à
la métamorphose (Figure 3.1.A.
③,
④et
⑤), le sex-ratio et l’âge des individus à la maturité
sexuelle (Figure 3.1.A.
⑥et
⑦). Ensuite, les effets du BaP et du TCS sur le transcriptome
hépatique ont été étudiés par mRNAseq chez des femelles matures issues des quatre
conditions d’exposition (Figure 3.1.A.
⑧). Parallèlement à cela et en relation avec les résultats
obtenus dans nos études précédentes (Chapitre 2), les effets des perturbateurs endocriniens
sur certains paramètres physiologiques (Figure 3.1.A.
⑨,
⑩,
⑪,
⑫et
⑬) et sur l’intégrité du
foie ont été évalués chez les mêmes femelles matures (Figure 3.1.A.
⑭et
⑮). Outre ces effets
directs sur les xénopes exposés, nous avons étudié les effets multigénérationnels sur leur
progéniture non exposée (génération F1, Figure 3.1.B). Pour conclure, le développement, la
croissance et la métamorphose des têtards de la descendance F1 ont été étudiés, après
reproduction des individus de la génération F0 (Figure 3.1.A.
⑯et
⑰et Figure.3.1.B.
①,
②,
Traits d’histoire de vie :
① Malformations – F0/F1 ② Mortalité – F0/F1 ③ Age à la métamorphose – F0/F1 ④ Taille à la métamorphose – F0/F1 ⑤ Poids à la métamorphose – F0/F1 ⑥ Age à la maturité – F0 ⑦ Sex-ratio – F0Transcription de gènes :
⑧ Transcriptome hépatique – F0♀Paramètres physiologiques :
⑨ Rapport hépato-somatique – F0♀⑩Contenu hépatique en lipide – F0♀
⑪Test de tolérance au glucose – F0♀
⑫Intensité respiratoire mitochondriale – F0♀
⑬Production espèces réactives de l’oxygène – F0♀
Intégrité hépatique :
⑭Observations histologiques – F0♀
⑮Activité alanine aminotransférase – F0♀
Succès reproducteur :
⑯Taux de fécondité – F0 ⑰Taux d’éclosion – F0F0 : génération exposée (50 ng.L )
F0
A
① ②
③ ④ ⑤
⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬
⑭ ⑮
⑯ ⑰
métamorphose maturitéF1
F1 : descendance non exposée
B
① ②
③ ④ ⑤
métamorphose
3.2 Méthodologie
3.2.1 Maintenance des xénopes
Les xénopes (Xenopus tropicalis) de la génération parentale F0 provenaient du Centre
de Ressources Biologiques Xénopes (CRB Xénopes) de l’Université de Rennes 1. Les têtards
âgés de sept jours à l’achat étaient au stade pré-métamorphique, la période larvaire
postembryonnaire durant laquelle le têtard est en croissance, sans modifications
morphologiques apparentes (Delarue et Arnoult, 2004).
3.2.1.1 Conditions de maintenance des xénopes
Les xénopes ont été maintenus dans des aquariums en verre thermo-pliés (sans joins
siliconés) d’une capacité de 10 L. L’eau utilisée pour la maintenance des têtards et des adultes
était un milieu recomposé, le milieu MMR (Marc's Modified Ringer's). Ce milieu a été dilué dix
fois (MMR 0,1X, Tableau 3.1) afin d’assurer la survie des xénopes. L’eau était thermostatée
à 25 ± 1 °C par bain-marie et l’oxygénation assurée par un bullage artificiel modéré. La
photopériode était de 12 h/12 h (nuit/jour). L’eau était renouvelée quotidiennement à
hauteur d’un litre et entièrement renouvelée hebdomadairement. Ce rythme de
renouvellement hydrique était assuré durant toute la durée d’exposition. L’aspiration d’eau
était automatisée par pompe péristaltique.
Tableau 3.1 : Composition du milieu MMR 0,1X pour le maintien des xénopes
Nom IUCPA Formule brute Molarité (M)
Chlorure de calcium CaCl2 2×10-4
Chlorure de magnésium MgCl2 1×10-4
Chlorure de potassium KCl 2×10-4
Chlorure de sodium NaCl 1×10-2
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (HEPES) C8H18N2O4S 5×10-4 (pH 7,5)
Les xénopes sont des amphibiens grégaires qui nécessitent d’être maintenus en
groupe. Suivant les recommandations du Centre de Ressource Biologique Xénope de
Rennes, la densité de jeunes têtards âgés de deux semaines était de 50 individus pour 2 litres
de milieu, correspondant à 2 aquariums par condition d'exposition, conditions décrites ci
après (3.2.1.2). Afin de répondre au besoin en volume durant la croissance des individus, ces
derniers ont été déplacés dans de plus grands aquariums avant le début de la phase de
métamorphose (équivalant pour chaque condition à 2 aquariums de 30 individus âgés de 30
jours pour de 4 litres de milieu). En fin de métamorphose les xénopes ont été répartis dans
de plus d'aquariums (équivalant pour chaque condition à 4 aquariums de 10 individus âgés
de 150 jours pour de 4 litres de milieu) (Figure 3.1.1).
Témoins BaP TCS BaP/TCS
Age : 15 jours
Densité :50 xénopes / 2 L de milieu
Age : 30 jours
Densité : 30 xénopes / 4 L de milieu
Age : 150 jours
Densité : 10 xénopes / 4 L de milieu