Méthodes utilisées pour purifier des complexes RNP .1 Techniques de chromatographie d’affinité MS2/MBP

Les ARN utilisés pour cette méthodologie contiennent trois sites de fixation de la protéine MS2 du phage R17 (phage R17-MS2 coat protein). La protéine de fusion MS2/MBP est composée de la protéine MBP et de la protéine MS2 (Maltose Binding Protein) L’ARN (100 pmol) est repris dans 50 μl de tampon D, dénaturé pendant 10 min à 65°C, puis renaturé 10 min à température ambiante et placé dans la glace. La protéine MS2/MBP (500 pmol) est ensuite ajoutée et le volume final est ajusté à 100 μl avant d’être incubé 20 min dans la glace.

Le complexe formé [ARN-MS2/MBP] est ensuite fixé sur 40 μl de billes d’amylose pendant 1h à 4°C sous agitation constante. Les billes sont isolées par centrifugation 1 min à 11000 rpm, puis lavées à 3 reprises avec 500 μl de Tampon D. Les complexes formés

[billes-ARN-101

MS2/MBP] sont incubés 15 min à 4°C sous agitation constante, en présence d’1 mg d’extrait nucléaire et 5 µM d’ARNt de levure. Les billes sont à nouveau isolées par centrifugation d’1 min à 11000 rpm, puis lavées 3 fois avec 500 μl de TpD pendant 10 min. Les complexes RNP sont élués avec 70 μl de tampon D complémenté en maltose à raison de 10 mM final lors d’une incubation de 30 min sous agitation constante à 4°C.

Puis, 20 μl de bleu SBL (Tris pH 6,8 250 mM ; SDS 8% ; β-mercaptoéthanol 20% ; bleu de bromophénol 0,04%) sont ajoutés à 50% de l’éluat et les protéines sont fractionnées sur gel SDS-PAGE 10% Acryl-bisacryl (29/1). Après migration, le gel est coloré au bleu colloïdale (sulfate ammonium 10% ; bleu de Coomassie G250 0,1% ; ac. Orthophosphorique 1,6% ; EtOH 20%). Dix pourcent des éluats sont analysés par Western-blot.

3.2 Techniques d’immunosélection des complexes RNP 3.2.1 Principe

Différents fragments radiomarqués de la région des A-repeats sont incubés en présence d’un extrait nucléaire de cellules ES dans le but de former des complexes RNP. Puis, les protéines du complexe PRC2 et la protéine PTB sont immunosélectionnées grâce à des anticorps spécifiques : Ezh2 (ENX-1 H-80, sc-25383), RbAp46 (ab3535), anti-RbAp48 (ab488), anti-Eed (ab4469), anti-Suz12 (ab12073) and anti-PTB (cb NA63). La présence et l’identité des ARN présents dans les complexes RNP immunoprécipités sont détéctées par fluorographie.

3.2.2 Préparation des ARN

Pour cette méthode, les ARN sont radiomarqués à leur extrémité 5’, le mélange réactionnel suivant est réalisé :

Déphosphorylation de l’extrémité 5’ des ARN

ARN à déphosphoryler (1 µg/µl) 1 µl

Tampon CIP 10X (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 ; MgCl2 0,1 M) 1 µl Calf Intestine Alkaline Phosphatase (Fermentas) (1U/µl) 1 µl

H2O qsp 10 μl

Les ARN sont incubés 1 h à 37°C puis 5 min à 65°C. Ils sont ensuite extraits au phénol/chloroforme, puis précipités comme précédemment et repris dans 10 µl d’eau stérile.

Marquage en 5’ des ARN

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Le mélange est incubé 45 min à 37°C, puis les transcrits sont purifiés par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant, élués une nuit à 4°C sous agitation constante dans le tampon d’élution, et précipités comme décrit précédemment.

3.2.3 Préparation des billes

Quarante microlitres de billes G-sépharose sont centrifugés 1 min à 1000 rpm. Elles sont ensuite lavées à 3 reprises avec 500 µl de tampon d’immunosélection contenant NaCl 150 mM ; Tris-HCl 10 mM pH 8,0 ; Igépal 0,1%. Puis, 10 µl d’anticorps, 1,5 µl de BSA (10 mg/ml) sont ajoutés aux billes et le volume est ajusté à 300 µl avec le tampon d’immunosélection. Le mélange est incubé 2 h à 4°C sous agitation constante. Les billes sont ensuite centrifugées 1 min à 1000 rpm et lavées à 3 reprises dans 500 µl de tampon d’immunosélection.

3.2.4 Formation des complexes RNP, immunosélection et analyse

Pour la formation des complexes RNP, le mélange réactionnel réalisé est le suivant : Transcrit radiomarqué en 5’ (35 pmol/µl) 2 µl

ARNt de levure (20 µg/µl) 1 µl

Tampon D 2 µl

H2O qsp 9 μl

Incubation 5 min à 65°C pour la dénaturation de l’ARN

MgCl₂(62,5 mM) 1 µl

Incubation 5 min à température ambiante pour renaturer l’ARN Incubation 5 min à 4°C

Extrait nucléaire 30 µg

Inhibiteur de RNases (RNasin, 20 U/µl, Amersham Biosciences) 1 µl

Tampon D qsp 30 µl

Incubation 30 min à température ambiante sous agitation ambiante

Les complexes RNP sont ensuite incubés avec les billes G-sépharose pendant 2 h à 4°C sous agitation dans un volume ajusté à 300 µl avec du tampon d’immunosélection. Puis, les billes sont centrifugées 1 min à 1000 rpm et le surnageant est supprimé. Après 3 lavages de 10 min à 4°C sous agitation avec 750 µl de tampon de lavage contenant NaCl 150 mM ; Tris-HCl 10 mM pH 8,0 ; Igépal 0,5%, les ARN sont extraits au phénol/chloroforme et précipités à l’éthanol 96% en présence de 0,3 M d’acétate de sodium final. Le culot est repris dans 15 µl de bleu de formamide et fractionné en gel de polyacrylamide/urée dénaturant à 7%. Après migration et séchage, le gel est placé en fluorographie une nuit à -80°C.

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3.3 Analyses des complexes ARN/Protéines par pontage covalent aux UV suivi d’immunosélection

La formation des complexes RNP est réalisée comme décrit précédemment lors des expériences d’immunoprécipitation des complexes RNP. A noter seulement que les transcrits doivent être marqués uniformément selon le protocole présenté dans la section retard sur gel.

3.3.1 Préparation des billes G-sépharose

Les billes sont préparées selon le protocole présenté dans la section précédente.

3.3.2 Préparation des puits

Une plaque de 96 puits est utilisée. Les puits sont saturés avec une solution contenant 20 μg de BSA dans 25 μl de tampon D. Une incubation de 30 min à température ambiante est nécessaire, puis les puits sont lavés à 2 reprises en tampon D. Puis, la plaque est placée sur un lit de glace.

3.3.3 Préparation du mélange réactionnel Le mélange réactionnel est le suivant :

Transcrit uniformément radiomarqué 500000 cpm

ARNt de levure (20 µg/µl) 1 µl

Tampon D 2 µl

H2O qsp 9 μl

Incubation 5 min à 65°C pour la dénaturation de l’ARN

MgCl2(62,5 mM) 1 µl

Incubation 5 min à température ambiante pour renaturer l’ARN Incubation 5 min à 4°C

Extrait nucléaire 30 µg

Inhibiteur de RNases (RNasin, 20 U/µl, Amersham Biosciences) 1 µl

Tampon D qsp 30 µl

Incubation 30 min à température ambiante sous agitation ambiante

3.3.4 Pontage covalent aux UV entre les protéines et les ARN et immunosélection

Chaque échantillon est transféré dans un puits de la plaque placée ensuite sous une source UV ( = 254 nm ; Biolink) à 3000 Joules/cm². L’échantillon est transféré à nouveau dans un tube Eppendorff dans lequel sont ajoutés 15 μg de RNase A et incubé 45 min à 50°C.

De cette solution est prélevé 1 µl auquel sont ajoutés 10 µl d’eau et 3 μl de bleu SBL 4X. Cet échantillon correspond à l’input avant immunoprécipitation. L’immunosélection est réalisée selon le protocole présenté dans la section précédente. Puis, les ARN sont élués par ajout de 15 µl de bleu SBL 4X sur les billes culotées. Elles sont ensuite vortexées et chauffées 5 min à

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96°C. L’échantillon est centrifugé pendant 5 min à 13000 rpm. Le surnageant est fractionné sur gel SDS-PAGE 10% et analysé par fluorographie.

4 Production de protéines recombinantes chez E.coli