les complexes sont analysés par des expériences d’empreintes aux RNAses

Le mélange réactionnel est incubé avec l’enzyme selon les conditions décrites ci-avant et les réactions sont arrêtées après 10 min d’incubation à 30 °C. L’arrêt des réactions est suivi par une extraction au phénol/chloroforme et par une précipitation à l’éthanol 96% en présence de glycogène (10 µg). Le culot d’ARN est alors lavé dans 200 µl d’éthanol à 70%, séché, puis resuspendu dans 7 µl d’eau stérile. Les ARN modifiés sont stockés à -80°C. L’analyse des coupures enzymatiques se fait par extension d’amorce.

5.2 Analyses des complexes ARN/Protéines par dichroïsme circulaire

Le dichrographe utilisé est un CD6 Jobin Yvon. Les mesures sont réalisées avec un incrément de 0,2 nm/s avec un volume d'échantillon de 550 µl dans chaque compartiment d’une cuve de 2 x 0,437 cm de trajet optique. Le spectre du tampon (Tris-HCl 10 mM pH 7,5;

NaCl 150 mM ; filtré à 0,22 µM) est réalisé avant chaque mesure puis il en est soustrait. Deux spectres sont effectués pour chaque mesure puis ils sont moyennés pour minimiser le bruit de fond. Pour la réalisation du spectre de la protéine et de l'ARN, nous avons utilisé une concentration de 0,2 µM. Le résultat est présenté en Δε M^-1.cm^-1 par résidus selon la loi de Beer-Lambert. La sensibilité de l'appareil est de 10^-6 ΔΑ soit 0,03 Δε (M^-1.cm^-1 par nucléotide).

Pour l'étude de l'interaction, le spectre «avant interaction» a été réalisé en déposant l'ARN et la protéine d’intérêt séparément de chaque côté de la cuve à une concentration de 0,2 µM. Puis le spectre «après interaction» est réalisé après mélange du contenu de la cuve. Le résultat est présenté en Δε par acide nucléique car le pic à 260 nm caractéristique des ARN est indépendant de l’absorption des protéines.

6 Techniques utilisées pour étudier l’épissage de la région des A-repeats 6.1 Méthodes spécifiques de l’étude de l’épissage in vitro

6.1.1 Préparation de la matrice de transcription

Afin de limiter la transcription à la région étudiée, le plasmide matrice est préalablement hydrolysé par une enzyme de restriction adéquate. L’ADN est ensuite soumis à deux extractions, l’une au phénol/chloroforme (1/1) et la seconde par un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24/1). Puis l’ADN est précipité à l’éthanol en présence d’acétate de sodium 0,3 M et finalement repris dans l’eau.

108 6.1.2 Transcription in vitro

Le protocole expérimental utilisé pour la transcription des ARN d’intérêt est le suivant :

Matrice linéarisée (200 ng/µl) 10 µl

Tp 5X (MgCl2 30 mM ; Spermidine 10 mM ; NaCl 50 mM ; Tris-HCl 200 mM, pH 7,5) 8 µl

rNTP (A, C, T, G ; 5, 5, 5, 2 mM) 4 µl

Cap 5m7GpppG (10 mM) 2 µl

Inhibiteur de RNases (RNasin, 20 U/µl, Amersham Biosciences) 2 µl

BSA (2 mg/ml) 2 µl

DTT (200 mM) 2 µl

ARN polymérase T7 2 µl

H2O 8 µl

Incubation pendant 2 h à 37°C

Après une étape de dégradation de la matrice ADN comme décrit précédemment, les ARN sont soumis à deux précipitations successives dans l’éthanol absolu, la première se faisant en présence d’acétate d’ammonium 0,25 M et la seconde, en présence de NaCl 0,2 M. Ces étapes de précipitations permettent d’éliminer les nucléotides non incorporés. Le précipité d’ARN est lavé deux fois dans de l’éthanol à 70%, puis séché, repris dans de l’eau stérile et la quantité de transcrits obtenue est déterminée.

6.1.3 Epissage in vitro

Les expériences d’épissage in vitro sont réalisées avec des extraits nucléaires de cellules HeLa provenant de la société CilBiotech. Le mélange réactionnel est le suivant :

ARN pré-messager (10 fmol/µl) 2 µl

MgCl2 (62,5 mM) 1 µl

ATP (25 mM) 1 µl

Créatine phosphate (625 mM) 1 µl

Inhibiteur de RNases (RNasin, 20 U/µl, Amersham Biosciences) 0,5 µl

Tampon D 3,5 µl

Alcool polyvinylique 13% 6 µl

Extrait nucléaire (10 mg/ml, traité au préalable 10 min à 30°C) 8 µl Incubation 5 min à 0°C puis 2h à 30°C

La réaction d’épissage est ensuite arrêtée par ajout de 20 μg de protéinase K (Roche) fonctionnant dans le tampon suivant : EDTA 12,5 mM ; NaCl 150 mM ; SDS 1% ; Tris-HCl 100 mM, pH 7,4. Après une incubation de 30 minutes à 30°C, les protéines sont extraites au phénol/chloroforme (1/1), puis au chloroforme/alcool isoamylique (24/1) et les ARN sont précipités en présence d’éthanol absolu sans ajout de sels. Le précipité est lavé puis séché et repris dans 10 μl d’eau stérile.

6.1.4 Conversion des ARN en ADN complémentaires par RT-PCR Hybridation de l’oligonucléotide complémentaire à l’extrémité 3’ des ARN

ARN 2 µl

Amorce (5 µM) 1 µl

109 Inhibiteur de RNases (RNasin, 20 U/µl, Amersham Biosciences) 1 µl Transcriptase inverse (MMLV, 200 U/µl, Promega) 1 µl Incuber 1H à 42 °C puis conserver à -20°C

Le mélange est soumis au programme PCR suivant : Dénaturation : 5 min à 96°C

Dénaturation : 45 sec à 96°C

Hybridation : 45 sec à 58°C cycle reproduit 29 fois Elongation : 1 min à 72°C

Terminaison : 10 min à 72°C

Les produits PCR amplifiés sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d’agarose 1% après l’ajout de bleu de dépôt agarose (6X). Les séquences des oligonucléotides utilisés pour les expériences de RT-PCR sont répertoriées dans le tableau suivant :

Oligonucléotide 5'-3' Utilisation 3899 - GGCTCGAGAATAGCCGTA RT 3900 - CCACCAAGCCTTATGGCT PCR 3898 - ACGCAGAAGCCATAATGGC

6.2 Méthodes spécifiques de l’étude de l’épissage in vivo 6.2.1 Dosage de l’activité luciférase

Les cellules sont transfectées par un plasmide portant le gène de la luciférase « Fire-Fly » sous contrôle du promoteur Xist. La mesure de l’activité luciferase se fait de la manière suivante : les cellules transfectées sont lavées à 2 reprises avec du PBS 1X. Puis, 250 µl de tampon de lyse (Cell Lysis Buffer, Promega) sont ajoutés dans chaque puit et incubés pendant 15 à 20 min à température ambiante. Le lysat est récupéré puis centrifugé 5 min à 13000 rpm et le surnageant est conservé à -20°C. Dans une cuve du luminomètre, 50 µl de la solution du substrat luciférase « fire-fly » (Promega) sont mélangé à 5 µl de lysat cellulaire. La cuve est ensuite placée dans l’appareil et l’émission de la lumière est mesurée durant 10 s.

110 6.2.2 Extraction des ARN totaux et RT-PCR

Les cellules HeLa transfectées sont lavées au PBS 1X et les ARN totaux sont extraits des cellules au Trizol selon les spécifications du fournisseur (Invitrogen). Après une étape de dégradation des ADN par utilisation de la DNase RQ1 (décrit précédemment), les ARN d’intérêt sont convertis en ADN complémentaires selon le protocole de RT-PCR exposé précédemment. Seule la quantité de matrice ARN utilisée pour l’étape de transcription inverse varie et atteint 4 µg. En effet, la population en ARN d’intérêt par rapport à la totalité des ARN cellulaires est beaucoup plus faible que lorsqu’on travaille avec des ARN synthétiques. ). Les séquences des oligonucléotides utilisés pour les expériences de RT-PCR sont répertoriées dans le tableau précédent.