Expérience d’empreinte en extrait nucléaire 1 Objectifs et stratégie expérimentale

Les expériences d’empreinte par des RNases ont été réalisées dans des conditions similaires à celles utilisées pour l’étude de la structure 2D des ARN. Elles devaient nous permettre de savoir si de grands segments de la région des A-repeats étaient protégés par des protéines de l’extrait nucléaire et donc constituaient des sites de fixation pour ces protéines.

L’apparition de grands changements d’accessibilité aux enzymes de certains segments pouvait aussi refléter des changements de structure de l’ARN.

Etant donné que la région des A-repeats est très conservée entre l’homme et la souris et bien que les études aient été réalisées sur l’ARN de souris (ARN-AM), nous avons utilisé des extraits nucléaires de cellules HeLa, qui étaient disponibles au laboratoire, pour réaliser ces expériences. Tout d’abord, il a fallu mettre au point les conditions de formation des complexes. Le point important était de définir les quantités d’extrait nucléaire à utiliser pour que les complexes soient formés, sans pour autant que des agrégats se forment du fait d’un excès de protéines nucléaires. Par des expériences de retard sur gel, nous avons défini les concentrations relatives en ARN et en extrait nucléaire requises pour obtenir une complexation totale de l’ARN. Un mélange d’ARN-AM non marqué à une concentration de 0,06 µM et d’une très faible quantité de ce même ARN uniformément marqué par incorporation d’UTP[α³²P] lors de la transcription (25 pM) a été incubé dans les conditions décrites dans la partie Matériel et Méthodes, ceci en présence de différentes quantités d’extrait nucléaire préparé par la société CilBiotech (0,5 à 3 µl à 10 µg/µl). Les complexes ARN/protéines formés ont été fractionnés par électrophorèse en gel de polyacrylamide non dénaturant à 3,5%. L’ARN était déjà totalement complexé en présence d’1 µl d’extrait nucléaire (Fig. 51). Pour réaliser les expériences d’empreinte, nous avons donc choisi

d’utiliser 4 quantités différentes d’extrait nucléaire inférieures ou égales à ce seuil : 0,1 ; 0,25 ; 0,5 et 1 µl.

3.2 Résultats obtenus

La formation des complexes entre l’ARN-AM et les composants de l’extrait nucléaire a été réalisée dans des conditions où les extraits nucléaires sont actifs, et notre référence d’activité au laboratoire est leur capacité à catalyser des réactions d’épissage in vitro (voir la partie Matériel et Méthodes). Des hydrolyses par les RNases T1 et T2 ont ensuite été réalisées sur les complexes, ceci en employant les conditions d’hydrolyse utilisées pour les études de structure 2D. Les positions de clivage ont été identifiées par extension par la transcriptase inverse des amorces déjà définies pour les analyses de structure 2D (3757, 3758, 3760 et 3866) (Fig. 40). Des exemples représentatifs de fractionnements des ADNc produits sont donnés dans la Figure 52a-d et les résultats obtenus sont représentés de manière schématique dans la Figure 53. Par souci de clarté, les Figures 52 (Fig. 5 annexe) et 53 (Fig. 6 annexe) sont également données en annexe de l’article.

Figure 51 : Analyse par retard sur gel des complexes formés après incubation de l'ARN-AM en présence d'extrait nucléaire de cellules HeLa

Un mélange de transcrit radioactif (0,5 fmol) et de transcrit non radioactif (1,2 pmol) a été incubé en présence de 0; 0,5;

1; 2; 3 µl d'extrait nucléaire de cellules HeLa (EN à 10 µg/µl) et de 5µg d'ARNt dans les conditions décrites dans la partie Matériel et Méthodes. Après électrophorèse en gel non dénaturant (polyacrylamide à 3,5%, glycérol 5%) en tampon TBE, les positions des ARN libres et des ARN complexés ont été mises en évidence par autoradiographie.

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Figure 52 : Analyse de la protection contre l'action des RNases générée sur l'ARN-AM par fixation des protéines d'un extrait nucléaire de cellules HeLa

Le transcrit a été soumis à une hydrolyse ménagée par les RNases T1 et T2 (0,5 U/1,2 pmol d'ARN) après incubation en présence ou en absence d'extrait nucléaire de cellules HeLa. Les conditions sont décrites dans la partie Matériel et Méthodes. Les positions des coupures ont été identifiées par extension des oligonucléotides 3760 (a.), 3866 (b.), 3758 (c.) et 3757 (d.) marqués en 5'. Les arrêts d'extension ont été positionnés dans la séquence grâce à des séquençages du transcrit réalisés avec les mêmes oligonucléotides (pistes U, G, C, A). Les ADNc ont été fractionnés par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant à 7%. Les positions des nucléotides sont indiquées à gauche de l'autoradiographie. La formation de complexes et les hydrolyses ont été réalisées en présence de MgCl₂ à une concentration de 3,125 mM.

Le contrôle 1 (piste Contr 1) a été réalisé en absence de RNase et en absence d'extrait nucléaire (EN). Le contrôle 2 (Contr 2) a été réalisé en absence de RNase et en présence de 1 µl d'extrait nucléaire. Les zones protégées sont indiquées à droite des autoradiographies par des cercles dont l'intensité est proportionnelle au degré de protection.

Les répétitions présentes dans la région des A-repeats sont indiquées par des rectangles à droite des autoradiographies.

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Figure 53 : Représentation des protections contre l’hydrolyse par les RNases T1 et T2 générées par fixation des protéines d’un extrait nucléaire de cellules HeLa sur la région des A-repeats

D'après les résultats obtenus présentés dans la Figure 52, les zones protégées ont été indiquées sur le modèle 3 de structure 2D proposé pour l'ARN-AM par des cercles avec le code couleur indiqué dans l’encart en haut à droite. Le numéro des répétitions est indiqué en rouge.

Seulement 50% de l’ARN-AM ont été analysés au cours de ces expériences mais les segments analysés incluent les répétitions 1, 3, 4, 5, 7 et 8, et des informations intéressantes peuvent être tirées des données obtenues :

- du fait de leur protection en extrait nucléaire, une grande partie des segments en simple brin devait être associée à des protéines de l’extrait. C’est en particulier le cas des très grandes boucles (régions 317 à 334, 436 à 442, 478 à 494, 690 à 703) riches en résidus U. Notons que le niveau de protection varie le long de ces segments en simple brin, avec une forte protection des parties très riches en résidus U et une protection beaucoup plus faible au niveau des extrémités 3’. L’absence de protection des extrémités 3’ est un fort argument en faveur du maintien de l’appariement des répétitions 2 à 2. En effet, le repliement des répétitions sur elles-mêmes selon le modèle de Wutz (Fig. 2 article) aurait conduit à une protection des extrémités 3’ des répétitions du fait de leur implication dans une hélice. Plusieurs protéines contenues dans les extraits nucléaires de cellules HeLa sont connues pour se fixer sur des régions riches en résidus U (PTB, KSRP, hnRNP C1/C2 par exemple). La dissymétrie de protection observée pour les grands segments en simple brin reliant les répétitions 3 et 4 d’une part et les répétitions 7 et 8 d’autre part, régions que nous avons entièrement analysées, suggérait : d’une part que la structure 3 est conservée dans les complexes formés en extraits nucléaires et d’autre part, que les protéines associées à ces segments ont une forte affinité pour les enchaînements de résidus U.

- en ce qui concerne la partie des répétitions qui est impliquée dans la formation des hélices, nous notons, pour celles qui ont été analysées (1, 4, 5 et 8), une protection des résidus proposés pour être en boucle. Comme ces boucles sont présentes dans tous les types de structure 2D proposés, cette protection ne reflète pas un changement de structure 2D mais une protection générée par la fixation de protéines. Il doit donc exister des protéines capables de se lier à ces petites boucles internes.

- par contre, au sein des hélices, les résidus G des répétitions 1, 4 et 5 (G351, G519 et G585) sont accessibles aux RNases, ce qui suggère une absence de fixation de protéine sur les hélices correspondantes.

L’examen des segments protégés suggérait donc l’implication de protéines ayant une forte affinité pour les segments riches en résidus U ; ce qui est le cas pour la protéine PTB car les séquences optimales pour sa fixation sont UCUU(C), UUCUCU ou CUCUCU (Perez et al., 1997). C’est également le cas de la protéine KSRP qui se lie aux séquences AUUUA. Des études de pontage in vitro aux UV avaient permis à d’autres auteurs (Brown et Baldry, 1996) de mettre en évidence l’interaction d’une protéine de 40 kDa avec la région 5’ de l’ARN Xist.

Ces auteurs avaient proposé qu’il s’agisse de la protéine hnRNP C1/C2 qui se lie aux séquences poly(U), AGUA(U)5GUGGA. Cette protéine hnRNP C1/C2 était donc aussi un partenaire possible de la région des A-repeats.

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De manière générale, les fortes protections de la région des A-repeats que nous avons observées en extrait nucléaire pouvaient correspondre à trois catégories de protéines :

1. Des protéines pouvant renforcer la stabilité de la structure 2D. Cela pouvait être le cas pour PTB dans la mesure où cette protéine possède 4 domaines de fixation à l’ARN fixant chacun des séquences riches en résidus U. Nous pouvions ainsi envisager qu’en se liant par ses domaines de liaison à l’ARN aux brins d’une grande structure tige-boucle SLS1 ou SLS3, PTB puisse stabiliser ces grandes structures tige-boucle.

2. Des protéines plateformes pouvant recruter des protéines fonctionnelles ayant un rôle dans l’inactivation.

3. Des protéines pouvant être impliquées dans l’inactivation, soit en se liant directement à l’ARN, soit en se liant par l’intermédiaire de protéines plateformes.

Comme nous l’avons décrit dans l’introduction, les données sur les partenaires protéiques de la région des A-repeats étaient très disparates et les études des interactions possibles peu approfondies. Les expériences de RIP réalisées récemment suggérent fortement que deux des protéines du complexe PRC2, Ezh2 et Suz12 interagissent avec la région des A-repeats (Zhao et al., 2008), mais les démonstrations expérimentales ne sont pas irréfutables.

Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction, les protéines SATB1/B2 pourraient aussi être associées à la région des A-repeats mais aucune preuve expérimentale n’est disponible.

De plus, la protéine SAF-A/hnRNP U co-localise avec le chromosome X inactif et la fixation de cette protéine sur le Xi dépend de son site de fixation aux ARN. D’après ces données, SAF-A/hnRNP-U pourrait être également un partenaire de la région des A-repeats. Il faut souligner que lorsque nous avons abordé la thématique au laboratoire, aucune preuve directe de la fixation de protéine sur la région des A-repeats n’avait été obtenue. Pour mieux comprendre le mécanisme d’action de la région des A-repeats, il était crucial d’identifier ses partenaires.

B. Stratégie de purification et d’identification des complexes ribonucléoprotéiques