II. Principes et limites des méthodes par culture
2. Méthodes par comptage direct
a. Principe
Ces méthodes sont également basées sur la dégradation spécifique d’un substrat, avec coloration du produit de dégradation. Alors que la culture est réalisée en milieu liquide pour les méthodes par détermination du NPP, la culture est réalisée sur un milieu gélosé dans le cas des méthodes par comptage. Deux tests du fournisseur HyServe (Uffing, Allemagne) sont utilisés pour les indicateurs recherchés dans le cadre de ces travaux : Compact Dry EC pour la quantification des coliformes et Escherichia coli, et Compact Dry ETC pour la quantification des entérocoques. Les réactions enzymatiques impliquées dans ces tests sont présentées dans le Tableau 4. Pour le test Compact Dry EC, des sels biliaires sont ajoutés au milieu pour inhiber la croissance des bactéries Gram-positif. De même, le milieu Compact Dry ETC contient des antibiotiques pour sélectionner les entérocoques.
Les milieux sont fournis déshydratés dans des boîtes de contact pré-coulées d’une surface de 20 cm². La réhydratation du milieu est effectuée par application de 1 mL d’échantillon au centre de la plaque. Les microorganismes sont ainsi répartis sur toute la surface par capillarité.
Tableau 4 : Réactions enzymatiques impliquées dans les tests Compact Dry EC (coliformes et E. coli) et ETC (entérocoques) (Nissui, 2009)
Microorganismes cibles
Enzyme
recherchée Substrat spécifique
Coloration du produit de dégradation Coliformes ß-D-galactosidase 5-bromo-6-chloro-3- indoxyl- ß -D- galactopyranoside (Magenta-Gal) Rose - rouge
Escherichia coli ß-D-glucuronidase
5-bromo-4-chrolo-3- indoxyl- ß -D- glucuronide(X-Gluc) Bleu- violet Entérocoques ß-D-glucosidase 5-bromo-4-chrolo-3- indoxyl- ß -D-glucoside (X-Gluc) Bleu - vert
b. Quantification
La quantification s’effectue par comptage des colonies présentant la coloration recherchée. Si les microorganismes sont répartis aléatoirement sur la surface de la plaque et bien séparés les uns des autres, une colonie après incubation est considérée comme issue d’un microorganisme unique (ISO, 2001; Sutton, 2011). On parle d’Unité Formant une Colonie (UFC). Le comptage est plus complexe que pour la détermination du NPP car il est plus dépendant de l’interprétation de l’opérateur (éclairage, colonies qui se chevauchent…) (Sutton, 2011). L’incertitude liée au comptage peut être modélisée mathématiquement par la distribution de Poisson (ISO, 2001) : la variance de la distribution est égale à sa moyenne et l’écart-type relatif ou coefficient de variation CV peut être exprimé par rapport au comptage total C de la série (ISO, 2001; Sutton, 2011) :
(5)
Par exemple, pour un comptage de 48 colonies sur une plaque, le coefficient de variation est de 1/√48 = 14 %. La Figure 2 montre que l’incertitude sur le comptage s’accroit rapidement au fur et à mesure que le comptage de colonies décroît. Ainsi une gamme de comptage inférieure à 10 colonies ne peut être considérée que semi- quantitative du fait de son imprécision (ISO, 2001). De plus, le volume de travail est seulement de 1 mL pour cette méthode, contre 100 mL pour les tests par détermination du NPP décrits précédemment. En considérant comme quantifiables seulement les
comptages supérieurs à 10 UFC, la limite de quantification pour ces méthodes est de 1000 UFC/100 mL, ce qui est élevé.
Figure 2 : Coefficient de variation du nombre de colonies comptées dans une suspension parfaitement homogénéisée suivant la loi de distribution de Poisson (d'après ISO, 2001)
La limite haute de comptage n’est quant à elle pas fixée par rapport aux aspects statistiques, mais par rapport aux aspects pratiques et biologiques. De nombreux facteurs sont pris en compte : surface de culture, taille et comportement des colonies recherchées (essaimage possible). Le nombre généralement admis est 250 – 300 colonies (Sutton, 2011). En réalité, c’est une estimation plutôt subjective. Si le nombre de colonies est considéré comme proche de cet ordre de grandeur (Figure 3a), le comptage peut être effectué sur seulement 1/20ème de la surface de la plaque (1 cm²) à
au moins trois endroits différents, moyenné, et ramené à la surface totale. Si le nombre de colonies est trop important (Figure 3b), une dilution de l’échantillon est nécessaire.
Figure 3 : Exemple de résultats pour Compact Dry EC. Dans le cas (a), le nombre de colonies est considéré comme proche de 300 et seule une partie de la surface est comptabilisée. Dans le cas (b), le nombre de colonies est considéré comme trop important et la dilution supérieure doit être prise en compte
c. Aspects pratiques et économiques
Le fait que les milieux de culture soient pré-conditionnés dans les plaques permet un gain de temps important lié aux étapes de préparation des milieux et de coulage des boîtes, qui sont nécessaires pour les méthodes classiques de culture sur boîtes. Cela permet aussi aux tests d’être utilisés par des opérateurs novices et sur le terrain, car ces étapes de préparation sont assez complexes d’un point de vue technique (chauffage de la gélose, stérilisation des milieux de culture, coulage en conditions aseptiques…). La mise en culture consiste à réhydrater le milieu avec 1 mL d’échantillon (éventuellement dilué) au centre de la plaque. Cependant, un minimum d’entraînement est nécessaire pour le comptage après incubation.
Tableau 5 : Aspects pratiques et économiques des méthodes Compact Dry EC et ETC
Coûts
Matériel (hors étuves) 0 €
Réactifs et consommables 2 à 3 € / échantillon Durée et technicité de l’analyse
Mise en culture 2 min / échantillon (sans dilution) (Utilisateur novice)
Incubation 24 h à 37°C
Comptage 5 min / échantillon (Utilisateur entraîné) Stockage des réactifs
Température 1 – 30 °C
Durée 18 mois (Compact Dry EC) 12 mois (Compact Dry ETC) Déchets (poids) 10 g / échantillon
Le coût (hors main d’œuvre) d’une analyse par échantillon est faible (environ 2 €) et surtout aucun équipement spécifique n’est à prévoir à l’exception des étuves pour l’incubation. De plus, la quantité de déchets générée par échantillon est faible (Tableau 5). Les conditions de stockage des plaques pré-coulées sont compatibles avec une utilisation sur le terrain (Tableau 5).
3. Limites des méthodes par culture
a. Temps d’incubation nécessaire
Afin d’assurer la qualité des eaux usées distribuées, un système de surveillance est nécessaire, idéalement en temps réel. Les méthodes par culture présentent l’inconvénient majeur d’un temps d’incubation long (18 h au minimum), ce qui entraîne un intervalle de temps important entre le prélèvement de l’échantillon et la détection d’une éventuelle anomalie, et l’impossibilité d’une surveillance en continu. Cette problématique est également présente pour l’analyse des eaux de baignade, avec un décalage entre le prélèvement et la décision d’autorisation ou non de la baignade (Henry, 2013; Lebaron et al., 2005). Cependant, alors qu’il est impossible de maîtriser tous les facteurs influençant la qualité des eaux de baignade, le contrôle de l’efficacité du traitement est réalisable dans le cadre de la REUT. Ce contrôle peut s’effectuer par la vérification continue du bon fonctionnement des équipements, en admettant comme indicateur de la qualité biologique des paramètres physico-chimiques (comme la turbidité) qui peuvent être suivis en continu. Une variation de ces paramètres peut indiquer une dégradation de la qualité biologique des eaux distribuées (Jung et al., 2014).
b. Bactéries viables mais non cultivables
Les méthodes avec culture ont pour postulat qu’un microorganisme est considéré comme viable s’il est capable de se multiplier dans des conditions considérées comme optimales pour l’espèce recherchée. Cependant, plusieurs études ont montré que des bactéries soumises préalablement à certaines conditions deviennent incultivables dans un milieu pourtant considéré comme optimal pour leur croissance, tout en conservant d’autres signes de viabilité et même leur virulence dans certains cas pour les bactéries pathogènes (Barcina et al., 1989; Oliver, 2005, 2016; Pommepuy et al., 1996). Lorsqu’elle est soumise à un stress quelconque une bactérie peut entrer dans un état de « survie à long-terme » et perdre temporairement sa capacité à se dupliquer (Bogosian & Bourneuf, 2001). Mais ces bactéries peuvent récupérer un métabolisme
actif si les conditions redeviennent favorables (Oliver, 2016). On parle alors de bactéries viables mais non cultivables (Viable But Non Culturable, VBNC). La distinction entre « viabilité » et « cultivabilité » est toutefois sujette à caution puisque le changement d’état d’une bactérie peut changer également ses conditions optimales de culture. En d’autres termes, la bactérie n’est plus considérée comme cultivable dans son milieu habituel mais peut toujours être cultivable dans un autre milieu. Elle garde donc potentiellement son activité métabolique (Hammes et al., 2011; Kell et al., 1998). Dans d’autres cas, un stress peut conduire à l’inhibition du métabolisme cellulaire, notamment la synthèse des protéines. On parle alors de « dormance » (Oliver, 2016).
Pour définir la viabilité d’une cellule bactérienne, trois aspects principaux sont à prendre en compte (Figure 4) :
la présence d’acides nucléiques fonctionnels qui permettent la traduction / transcription et la réplication de l’ADN
la présence d’énergie (majoritairement sous forme d’ATP) qui permet le fonctionnement des processus cellulaires
la présence d’une membrane cellulaire intacte et fonctionnelle, qui permet l’intégrité de l’environnement intracellulaire
Figure 4 : Paramètres définissant la viabilité d'une cellule bactérienne (Hammes et al., 2011)
Un des processus cellulaires essentiels pour assurer la viabilité de la cellule bactérienne est le maintien d’un potentiel membranaire, c'est-à-dire une différence de tension électrique entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule. Le potentiel membranaire permet d’assurer plusieurs fonctions, comme la synthèse d’énergie ou le maintien de la pression osmotique et donc l’intégrité de la cellule (Hammes et al., 2011).
Les méthodes actuellement reconnues au niveau international pour estimer la contamination biologique des eaux ne permettent pas de s’affranchir de ce problème,
qui conduit potentiellement à la sous-estimation des populations de pathogènes. Néanmoins, les études épidémiologiques sont basées sur ces méthodes et ont montré qu’une relative confiance peut leur être accordée pour estimer le risque biologique (Cabral, 2010).
c. Association des microorganismes avec les particules en
suspension
Il y a plusieurs types d’associations entre les particules et les microorganismes en suspension. Pour ces derniers, les particules sont un support de croissance, pouvant servir de base au développement de biofilms. Il peut s’agir également d’une source de nutriments dans un milieu pauvre (Mamane, 2008; Paerl, 1975; Stevik et al., 2004). L’adsorption de microorganismes sur la surface d’une particule est régie par la théorie de la double couche, selon laquelle l’attraction s’opère au niveau de deux zones autour de la particule : une zone « proche » (à moins de 1 nm de la surface) et une zone « éloignée » (5 à 10 nm de la surface) (Chahal et al., 2016; Stevik et al., 2004). L’association particule-microorganisme s’effectue donc en deux étapes (Chahal et al., 2016; Hipsey et al., 2006) :
Adsorption : le microorganisme surmonte les forces de répulsion électrostatique et des liaisons faibles de type Van der Waal sont mises en place au niveau de la zone « éloignée ». Cette adsorption peut facilement être déstabilisée par l’application d’une contrainte physique, comme l’augmentation des forces de cisaillement.
Adhésion : des liaisons fortes de type liaison hydrogène ou liaison dipôle – dipôle se forment au niveau de la zone « proche » de la surface de la particule. Ces liaisons sont facilitées par la synthèse de polymères extracellulaires (EPS), ce qui représente une dépense d’énergie importante pour le microorganisme. La stabilité de ces liaisons est cependant très importante, et elles sont plus résistantes aux contraintes physiques.
Ce mécanisme d’association avec les particules est commun pour tous les types de microorganismes : bactéries, virus, oocystes… (Chahal et al., 2016). Il est cependant influencé par plusieurs facteurs, notamment la taille des particules (Tableau 6). Les bactéries peuvent s’associer avec des particules de diamètre supérieur à 10 µm (Emerick et al., 1999) tandis que les virus peuvent se lier avec des particules plus petites, de diamètre inférieur à 2 µm (Templeton et al., 2005). Les protozoaires d’une taille plus importante que les bactéries, comme Cryptosporidium, ne pourront s’associer qu’à des particules de diamètre supérieur à 25 µm (Amoah et al., 2005). Ce mécanisme d’agrégation de particules avec les microorganismes est exploité pendant le
traitement secondaire des eaux usées afin de former des flocs qui sont ensuite séparés de l’eau traitée pendant l’étape de clarification (Figure 5).
Tableau 6 : Résumé des facteurs affectant l'association des bactéries avec les particules (d'après Chahal et al., 2016)
Facteurs physiques
Température
Si la température décroît, cela diminue l’énergie disponible pour l’adsorption. L’adhésion est également plus difficile car la viscosité des polymères EPS augmente.
Débit
S’il augmente, cela diminue le temps de contact entre particules et bactéries. Les forces de cisaillement perturbent aussi l’adsorption.
Matière organique
dissoute Influence la charge positive ou négative des particules Composition et taille
des particules Influence le nombre de sites d’adsorption. Facteurs chimiques
pH
Peut influencer la charge de la surface des particules et des bactéries. Les particules et les bactéries sont plutôt chargées négativement à pH neutre.
Hydrophobicité Elle augmente pendant la phase de croissance exponentielle des bactéries, ce qui favorise l’adhésion aux particules.
Conductivité (force ionique)
Influe sur les forces d’attraction ou de répulsion électrostatiques. Si la conductivité de l’eau augmente, la répulsion augmente. La présence de cations (Ca2+, Mg2+,
Cu2+…) favorise au contraire l’adsorption.
Facteurs biologiques
Surface des cellules La présence d’appendices (flagelle, pili…) permet la mobilité et augmente la probabilité de contact bactérie – particule.
Taille des cellules Les bactéries les plus petites sont plus susceptibles de se loger dans les interstices des particules.
Polymères
extracellulaires (EPS)
Souvent des polysaccharides sécrétés pour former des liaisons stables avec les particules. Les bactéries pathogènes se développant peu dans l’environnement, elles sont moins susceptibles de produire des EPS.
Chimiotaxie Attraction des bactéries pour certains composés chimiques, ce qui peut jouer un rôle dans l’adsorption sur les particules. Concentration en
bactéries
L’agrégation des bactéries entre elles et sur les particules est liée à leur concentration dans le milieu.
L’association de microorganismes entre eux ou avec des particules a des conséquences sur leur dénombrement par les méthodes par culture. En effet, ces méthodes ont pour postulat que les microorganismes sont répartis aléatoirement dans le milieu, ce qui n’est pas le cas ici. Le risque est donc de sous-estimer la quantité de microorganismes recherchés : dans le cas de la détermination du NPP la répartition
des microorganismes dans les puits ne suit plus une distribution de Poisson, et dans le cas d’une culture sur plaque une UFC ne sera plus issue d’une cellule isolée, mais d’un agrégat de cellules (Borst & Selvakumar, 2003; Garcia-Armisen & Servais, 2009; Plancherel & Cowen, 2007). Cette limitation est identifiée depuis longtemps (Fleisher, 1990), mais les conditions limites à partir desquelles les méthodes par culture sont affectées par l’association des microorganismes avec les particules restent peu documentées. Pour mieux comprendre l’impact de la qualité de l’effluent sur le dénombrement des indicateurs par les méthodes par culture, il est donc nécessaire de distinguer de façon claire la fraction de microorganismes libres et celle en agrégats ou liée aux particules.
Figure 5 : Structure typique d'un floc bactérien (Farnood, 2014)