Analyses microbiologiques : PCR quantitative

Les analyses par PCR quantitative sont réalisées pour deux indicateurs : les entérocoques et Escherichia coli.

a. Extraction et purification de l’ADN

Cette étape est importante car elle doit permettre l’extraction de l’ensemble de l’ADN présent dans l’échantillon et sa purification pour éviter les interférences pendant la PCR. Il faut également choisir une méthode d’extraction qui permette de récupérer une quantité d’ADN cible suffisante pour être quantifiée. Les étapes d’extraction et de purification peuvent être réalisées simultanément par des kits commerciaux. Le kit choisi est le kit QIAamp DNAmicro de Qiagen. Les principales étapes du protocole d’extraction sont les suivantes (le protocole complet est présenté en Annexe A):

 filtration de 20 mL (conditions A et B) ou 5 mL (condition C) d’échantillon sur un filtre seringue en polycarbonate de pore 0,2 µm (Nucleopore, Whatman)

 dissolution du filtre

 ajout d’une solution d’enzyme lysozyme (20 mg/L) et incubation pendant 30 min à 37°C : cette étape permet d’hydrolyser les parois résistantes des bactéries Gram-positives

 Ajout de l’enzyme protéinase K et du tampon, et incubation à 56°C pendant 30 min, puis à 95°C pendant 15 min

 ajout de 50 µL d’éthanol (96 – 100%),

 purification de l’ADN sur une colonne de silice, élution dans un volume de 30 µL

Le volume filtré est de 5 mL au lieu de 20 mL pour la condition C car l’effluent étudié dans cette condition est plus chargé en MES. Le risque est donc de colmater le filtre et de ne pas récupérer la totalité de l’ADN de l’échantillon. Pour toutes les conditions, l’extraction est réalisée dans les deux heures après la prise d’échantillon. Après extraction, l’ADN est stocké à -20°C pour analyse ultérieure.

b. Mesure de la quantité d’ADN extraite

La quantité d’ADN dans un échantillon est directement proportionnelle à l’absorbance à 260 nm : une unité d’absorbance à 260 nm (pour une largeur de cuve de 1 cm) correspond à une concentration en ADN de 50 ng/µL (Kieleczawa, 2006; Thermo Scientific, 2008). La quantité d’ADN dans les échantillons après extraction est donc

estimée grâce à un spectrophotomètre (Nanodrop 2000/C, Thermo Scientific). Ce spectrophotomètre permet de réaliser les mesures avec seulement 1 µL d’échantillon (l’absorbance est ramenée à une largeur de cuve de 1 cm). Il donne également une estimation de la pureté de l’ADN extrait avec deux ratios (Thermo Scientific, 2008) :

 A260/A280 : indicateur de la contamination par des protéines. Dans l’idéal ce ratio est proche de 1,8.

 A260/A230 : indicateur de la contamination par des molécules organiques comme les phénols. Dans l’idéal ce ratio est proche de 2.

c. Choix des séquences amplifiées et cycles d’amplification

Le choix a été fait pour cette étude de travailler en PCR simple, c’est-à-dire en séparant les amplifications pour E. coli et pour les entérocoques. Cela évite les interférences possibles dans le choix des séquences amplifiées et dans la conception des amorces et des sondes. Les sondes choisies dans cette étude sont des sondes classiques par hydrolyse (également connues sous le nom de sondes TaqMan). Ce type de sonde est constitué d’une séquence d’acides nucléiques complémentaire à une partie de la séquence d’ADN à amplifier. Un fluorophore est attaché de manière covalente au niveau de l’extrémité 5’ de la sonde et un quencher est attaché de la même façon à l’extrémité 3’ (Figure 15). Le quencher inhibe la fluorescence émise par le fluorophore lorsqu’il est excité par une source de lumière. Lors de la phase d’élongation et de polymérisation de la séquence complémentaire à la séquence à amplifier, la polymérase dégrade la sonde déjà hybridée au brin d’ADN. Le fluorophore et le quencher se retrouvent donc séparés et il y a émission de fluorescence de façon directement proportionnelle à la quantité d’ADN cible présente (Bustin, 2004 et Figure 15).

L’hybridation spécifique des amorces et des sondes est essentielle pour une bonne réussite de la qPCR. La conception des sondes doit par ailleurs prendre en compte les prescriptions suivantes (Bustin, 2004) :

 l’extrémité 5’ de la sonde doit être proche de l’extrémité 3’ de l’amorce correspondante pour s’assurer d’une hydrolyse rapide de la sonde,

 la séquence ne doit pas être trop importante (30 nucléotides maximum),

 éviter d’avoir un nucléotide guanine (G) à l’extrémité 5’ de la sonde qui pourrait provoquer une interférence du même type que le quencher,

 éviter la succession de plus de 4 nucléotides identiques (surtout G),

 la température de fusion (Tm) de la sonde doit être de 10°C supérieure à la Tm

des amorces, habituellement entre 68 et 70°C. Ainsi on s’assure que l’hybridation des sondes sera effectuée avant l’élongation du brin complémentaire à partir des amorces.

Figure 15 : Principe de la PCR avec hydrolyse des sondes (VIC et FAM sont des fluorophores) (DNA Vision, 2016)

Pour cette étude, les analyses par PCR quantitative sont basées sur le gène uidA

pour E. coli car la fonction ciblée est la même que l’activité enzymatique ciblée par les méthodes par culture. Pour les entérocoques, la séquence du gène spécifique codant pour l’ARNr 23S (Frahm & Obst, 2003) a été retenue (Tableau 8). Les amorces et les sondes retenues sont celles utilisées par Frahm & Obst (2003) qui ont vérifié leur spécificité. Elles sont présentées dans le Tableau 13. Les amorces et sondes sont fournies par Eurofins Genomics sous forme déshydratée. Après réhydratation, chaque solution d’amorce est répartie dans des aliquotes de 10 µL (correspondant à 1 nmol d’amorce) et conservée à -80°C. Les solutions de sondes sont réparties dans des aliquotes de 5 µL (correspondant à 0,5 nmol d’amorce) et conservées à -80°C. Avant utilisation, les solutions d’amorces sont diluées à 1/20 (10 µL dans 190 µL), tout comme les solutions de sondes (5 µL dans 95 µL). Les dilutions sont réalisées avec de l’eau ultrapure.

Tableau 13 : Amorces et sondes utilisées dans le cadre des qPCR pour la quantification d’E. coli et des entérocoques. Pour les sondes, les fluorophores sont en couleur et les quenchers en gris (Tm : température de fusion).

Microorganisme Gène Type Séquence Concentration (nmol/L ou nM)

Tm

(°C)

Escherichia coli uidA

Amorce (forward)

5’-GTG TGA TAT CTA CCC

GCT TCG C-3’ 900 61,7 Amorce

(reverse)

5’-AGA ACG GTT TGT GGT

TAA TCA GGA-3’ 300 61,7 Sonde 5’-Cy5-TCG GCA TCC GGT

CAG TGG CAG T-BHQ2-3’ 200 71,9

Entérocoques ARNr 23S

Amorce (forward)

5’-AGA AAT TCC AAA CGA

ACT TG-3’ 200 53,1 Amorce

(reverse)

5’-CAG TGC TCT ACC TCC

ATC ATT-3’ 300 55,4 Sonde 5’-Rox-TGG TTC TCT CCG AAA

TAG CTT TAG GGC TA-TAM-3’ 360 67,2

Les compositions des mélanges pour les amplifications sont présentées dans le Tableau 14. Le PCR Mix est une solution prête à l’emploi contenant l’ADN polymérase, les bases azotées (dNTPs) et autres composés nécessaires à l’amplification (GoTaq Probe qPCR Master, Promega). Les amplifications sont réalisées par un thermocycleur qui permet également la mesure de fluorescence à chaque cycle (Rotor-Gene 6000, Corbett Research). La dénaturation de l’ADN est tout d’abord réalisée à 95°C pendant 3 minutes, puis 40 cycles d’amplification sont lancés. Chaque cycle comprend une phase de dénaturation à 95°C pendant 15 secondes puis une phase d’amplification à 60°C pendant 1 minute avec mesure de la fluorescence. Le résultat brut pour chaque échantillon est le CT, c’est-à-dire le nombre de cycles nécessaire pour atteindre un seuil

de fluorescence prédéfini. Plus la quantité d’ADN cible dans l’échantillon est importante, plus le CT est faible. Une gamme d’étalonnage est nécessaire pour

convertir ce CT en quantité d’ADN cible. Chaque échantillon est amplifié en triplicat.

Tableau 14 : Composition des mélanges pour les amplifications

Volume (µL) E. coli Entérocoques Échantillon 2 2 Amorce F 1,2 (¾ F et ¼ R) 0,8 Amorce R 1,2 Sonde 0,8 1,44 PCR Mix 10 10 Eau ultrapure 6 4,56 TOTAL 20 20

d. Préparation des gammes d’étalonnage

Pour chaque indicateur choisi, l’établissement d’une gamme étalon est nécessaire pour relier le CT au nombre de copies de l’indicateur initialement présentes dans

l’échantillon. Cette gamme d’étalonnage est réalisée à partir de cultures pures représentatives de chaque indicateur. Les souches choisies sont des souches certifiées ATCC (American Type Culture Collection) : il s’agit de la souche Escherichia coli ATCC 15597, et de la souche Enterococcus faecalis ATCC 19433 pour les entérocoques (Fisher Scientific). Le protocole d’établissement de la gamme d’étalonnage est le suivant :

 à partir d’un inoculum en fin de phase exponentielle stocké pendant moins de 24h, mise en culture dans 10 à 12 mL de milieu approprié : bouillon Luria- Bertani (LB) pour E. coli et bouillon Rothe pour E. faecalis (CONDA Microbiologie). Incubation à 37°C jusqu’à la phase de croissance exponentielle

 prélèvement de 1 mL pour mise en culture sur plaques (Compact Dry EC et ETC) après dilution pour vérification des souches

 centrifugation à 5000 G pendant 10 minutes

 remise en suspension du culot avec la solution de lysozyme et poursuite du protocole d’extraction précédemment décrit : l’extraction est réalisée dans un volume de 100 µL

 quantification de l’ADN au Nanodrop

 dilution en série de l’ADN (100 à 10-8) : 2 µL dans 18 µL d’eau ultrapure

 amplification des dilutions : voir protocole précédemment décrit

L’intégrité de l’ADN extrait est vérifiée par électrophorèse sur gel (tampon Tris- EDTA avec 1% d’agarose). Un tampon de charge est ajouté aux échantillons. Après migration, les échantillons sont marqués au bromure d’éthidium (BET).

Les dilutions et leur amplification sont réalisées en triplicat et en même temps que l’amplification des échantillons. La quantité d’ADN extraite pour chaque souche est convertie en nombre de copies de la souche testée en se basant sur les informations suivantes :

 taille du génome de la souche E. coli ATCC 15597 : 4670 Kb (Kilobase, équivalent à 1000 paires de bases d’ADN) (Smith et al., 1987)

 taille du génome de la souche E. faecalis ATCC 19433 : 3020 Kb (Oana et al., 2002)

 1 nanogramme d’ADN équivaut à 978.106 Kb (Bustin, 2004)

Ainsi le nombre de copies du microorganisme indicateur cible est donné par la relation suivante :

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La gamme d’étalonnage permet de relier le CT au nombre de copies de l’indicateur

recherché par unité de volume d’extraction pour chaque échantillon. Il faut ensuite prendre en compte le facteur de dilution lié à l’extraction pour obtenir la concentration dans l’échantillon de départ (en nombre de copies par mL) :

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Le facteur de dilution à prendre en compte est donc de 1,5 (30/20) pour les conditions A et B et de 6 (30/5) pour la condition C.