Impact des matières en suspension sur la fiabilité des méthodes de

a. Impact sur la quantification

Pour chaque condition, la qualité biologique des effluents est évaluée par trois indicateurs : Escherichia coli, coliformes et entérocoques. Les effluents sont analysés sans prétraitement ou après filtration à 5 µm. Trois méthodes de quantification sont utilisées : deux méthodes par culture (IDEXX et Compact Dry) et une méthode sans culture (qPCR). Pour cette dernière méthode, seuls les indicateurs E. coli et entérocoques sont évalués.

Figure 22 : Résultats de dénombrement pour les échantillons filtrés à 5 µm. Les échantillons marqués par un exposant différent (a-c) pour un indicateur donné sont significativement différents les uns des autres (test de Mann- Whitney, p < 0,05)

Les résultats de dénombrement pour les échantillons non filtrés sont présentés en Figure 21. Pour l’indicateur Escherichia coli, la teneur en microorganismes mesurée par la méthode IDEXX augmente d’un facteur 2 à 4 entre la condition A et la condition B, alors qu’il n’y a pas d’augmentation significative entre les conditions B et C. La méthode Compact Dry donne des résultats similaires, même s’il n’y a pas de données pour la condition B. Les résultats obtenus par qPCR et exprimés en nombre de copies du génome d’E. coli sont beaucoup plus élevés que les résultats des méthodes par culture exprimés en NPP ou en UFC. Cependant la même tendance est observée entre la condition A et la condition B : augmentation de la quantité de copies d’un facteur 2 à 5. La différence notable avec les méthodes par culture est qu’une augmentation du nombre de copies d’E. coli est observée entre les conditions B et C (d’un facteur 3 à 7).

Une augmentation de la teneur en entérocoques mesurée par les méthodes par culture est observée entre les conditions A et B (d’un facteur 3 à 7) (Figure 21). De la même façon que pour E. coli, il n’y a pas de différence significative entre les conditions B et C pour la méthode IDEXX. Les résultats obtenus par qPCR sont également beaucoup plus élevés que les résultats des méthodes par culture. Une augmentation importante du nombre de copies d’entérocoques est observée entre les conditions A et B (d’un facteur 14 à 30) et entre les conditions B et C (d’un facteur 10 environ) avec cette méthode de quantification.

La teneur en coliformes mesurée en NPP ou UFC augmente de façon proportionnelle à la quantité de MES dans l’effluent (R² = 0,9). Cet indicateur n’est pas mesuré par qPCR.

Les résultats de dénombrement par les méthodes par culture pour les échantillons filtrés à 5 µm sont globalement comparables aux résultats pour les échantillons non filtrés (Figure 22). Deux différences significatives peuvent néanmoins être soulignées :

 la teneur en coliformes mesurée par la méthode IDEXX reste stable entre les conditions B et C

 la teneur en entérocoques mesurée par la méthode IDEXX diminue également de façon significative entre les conditions B et C (test de Mann-Whitney, p < 0,05)

Concernant le dénombrement par qPCR, les même tendances que pour les échantillons non filtrés sont observées, avec une augmentation du nombre de copies entre les conditions A et B (d’un facteur 3 à 4 pour E. coli et 8 à 14 pour les entérocoques) et entre les conditions B et C (d’un facteur 2 environ pour E. coli et pour les entérocoques) (Figure 22).

Il est possible de comparer le comptage des particules de diamètre supérieur à 5 µm à la différence des teneurs mesurées par PCR entre les échantillons non filtrés et les échantillons filtrés à 5 µm (Tableau 19). Pour E. coli, le rapport entre ces deux valeurs est proche de 0 pour les conditions A et B comme les teneurs des échantillons filtrés sont égales aux teneurs des échantillons non filtrés. Le nombre de particules de taille supérieure à 5 µm est proche du nombre de cellules d’E. coli retenu sur un filtre de porosité 5 µm dans l’effluent le plus chargé. Pour les entérocoques, la quantité de cellules ramenée au nombre de particules de taille supérieure à 5 µm augmente fortement avec l’ajout de boue dans l’effluent secondaire.

Tableau 19 : Rapport entre la quantité de cellules retenues sur un filtre de porosité 5 µm et la quantité de particules de taille supérieure à 5 µm (mesurée par compteur optique) pour les deux indicateurs et les trois effluents étudiés. Les ratios sont calculés à partir des moyennes des valeurs mesurées.

Escherichia coli Entérocoques Condition A ≈ 0 0,95 Condition B 0,04 21,9 Condition C 1,3 141

b. Impact sur le rapport entre qPCR et méthodes par culture

Afin d’étudier les différences entre les deux méthodes par culture (IDEXX : NPP et Compact Dry : UFC), les couples de mesures sont présentés dans la Figure 23. Toutes les mesures sont regroupées pour l’ensemble des conditions et des indicateurs (échantillons filtrés et non filtrés). La droite de régression correspondante a une pente proche de 45° et un coefficient de détermination élevé (R² = 0,9). De plus, la comparaison des deux distributions avec un test de Wilcoxon signé (les échantillons sont appariés) confirme l’absence de différence significative (p = 0,829 > 0,05).

Figure 23 : Droite de régression entre les mesures avec la méthode IDEXX et la méthode Compact Dry. Le trait noir épais correspond à la régression sur l'ensemble des mesures (n = 46)

Le dénombrement par qPCR sur les mêmes échantillons donne des résultats significativement plus élevées, comme cela est montré dans le paragraphe précédent. Un ratio entre la valeur mesurée par qPCR et la valeur mesurée par les méthodes par culture (IDEXX et Compact Dry regroupés) peut être calculé pour chaque échantillon. Ces ratios sont présentés en Figure 24. Pour Escherichia coli, le dénombrement par PCR est 3 à 9 fois plus élevé que par les méthodes par culture pour la condition A (Figure 24A). Ce ratio n’est pas significativement différent pour la condition B (test de Mann-Whitney, p = 0,368 > 0,05). Pour la condition C, le ratio augmente significativement avec des valeurs entre 30 et 70. Cette augmentation est en lien avec les observations du paragraphe précédent : entre les conditions B et C la teneur en E. coli mesurée par qPCR augmente, alors qu’elle reste stable si elle est mesurée par IDEXX (Figure 21). Les résultats pour les échantillons filtrés à 5 µm sont comparables (Figure 24B).

Figure 24 : Ratios entre les valeurs mesurées par qPCR et par les méthodes par culture pour les trois conditions et les indicateurs E. coli (A – échantillons non filtrés et B – échantillons filtrés à 5 µm) et entérocoques (C – échantillons non filtrés et D – échantillons filtrés à 5 µm). Les échantillons marqués par un exposant différent (a-c) pour un indicateur donné sont significativement différents les uns des autres (test de Mann- Whitney, p < 0,05).

Pour les entérocoques, le ratio entre les valeurs mesurées par qPCR et les valeurs mesurées par les méthodes par culture est compris entre 30 et 70 pour la condition A (Figure 24C). Ce ratio est multiplié par 4 pour la condition B, avec des valeurs comprises entre 120 et 260. Pour la condition C, le ratio qPCR/méthodes par culture est 8 à 10 fois plus important que pour la condition B (Figure 24C). Les résultats pour les échantillons filtrés à 5 µm sont comparables (Figure 24D). Comme pour E. coli ces observations s’expliquent par une augmentation de la teneur en entérocoques mesurée par qPCR tandis que les valeurs mesurées en IDEXX diminuent pour la condition C (Figure 21).

c. Impact sur le rapport entre les échantillons non filtrés et

filtrés à 5 µm

La Figure 25 présente les rapports entre la valeur mesurée sur l’échantillon non filtré et la valeur mesurée sur l’échantillon filtré à 5 µm. Ce rapport est calculé à chaque condition pour les trois indicateurs et les trois méthodes étudiées. Pour

Escherichia coli, aucune différence significative n’est observée entre les méthodes de quantification et entre les trois conditions (test de Kruskal-Wallis, p = 0,086 > 0,05). La valeur du rapport est proche de 1, ce qui indique que l’on n’observe pas de différence entre les échantillons non filtrés et filtrés, même après l’ajout de boues (conditions B et C).

Les valeurs du ratio entre échantillons non filtrés et filtrés pour les coliformes sont comprises entre 1 et 2 pour la condition A. Aucune différence n’est observée entre les méthodes de comptage par culture. La valeur mesurée par la méthode IDEXX pour la condition B est également dans cet ordre de grandeur. Pour la condition C, le ratio entre échantillons non filtrés et filtrés est doublé (Figure 25).

Concernant les entérocoques, la valeur du ratio entre les teneurs avant et après filtration à 5 µm est également proche de 1 pour la condition A. Le test de comparaison par paires de Conover-Iman avec la correction de Bonferroni ne met pas en évidence de différences significatives entre les trois méthodes de quantification pour cette condition. Pour la condition B, les ratios déterminés par qPCR sont significativement plus élevés que les ratios déterminés par IDEXX (p < 0,001). Pour la condition C, le rapport entre les échantillons non filtrés et filtrés à 5 µm est globalement plus important (valeurs comprises entre 10 et 30). Aucune différence significative n’est observée entre les ratios déterminés par IDEXX, Compact Dry, ou qPCR même si les valeurs déterminées avec cette dernière méthode sont légèrement plus élevées (Figure 25).

Figure 25 : Rapports entre les teneurs mesurées sur les échantillons non filtrés et les échantillons filtrés à 5 µm pour les trois indicateurs étudiés. Le trait vert en pointillés représente un ratio égal à 1. Les échantillons marqués par un exposant différent (a-c) pour un indicateur donné sont significativement différents les uns des autres (test de Kruskal-Wallis, suivi par la procédure de comparaison par paire de Connover-Iman avec correction de Bonferroni, p < 0,05).