Méthodes de caractérisation

1. Observation en microscopie électronique à transmission (MET)

Tous les échantillons ont été préparés et observés avec l’aide de Melina Petrel, ingénieur d’étude au Bordeaux Imaging Center.

Culture DO₆₀₀0,1

5% polyphénol (10mg/ml) 5% éthanol

1.1. Observation des bactériophages

Un lysat phagique initial de 25 ml, fraîchement produit, est filtré sur membrane PES 0,22 μm puis

conservé à 4°C. Le lysat (environ 109 UFP/ml) est centrifugé à 20000 g (Himac CR22N, Hitachi)

pendant 2h à 4°C (Marie-Agnès Petit, communication personnelle) afin de concentrer les particules virales sans altérer leur intégrité, en vue de leur observation. Le culot est soigneusement égoutté et recouvert de tampon phage. Après 30 min de contact, le culot est repris soigneusement par une série d’aspirations-refoulements doux.

La coloration négative des échantillons est obtenue en déposant 10 μl de suspension virale sur une grille cuivre 200 mesh formvar carbone (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis). Après 30 sec de contact, l’excès de liquide est éliminé en inclinant et déposant la tranche de la grille sur papier filtre Watteman N°1. Un volume de 10 μl de solution d’acétate d’uranyle à saturation dans l’eau est déposé sur la grille pendant 30 sec. Après élimination de l’excès de colorant et séchage, l’observation est effectuée sur un microscope électronique à transmission Hitachi H7650 à 80 kV en haute résolution.

1.2. Observation de cellules d’O. oeni

Fixation des cellules

Un volume de 10 ml de suspension bactérienne a été collecté en phase exponentielle de croissance

puis centrifugé à 10000 g pendant 5 min. Le culot est repris dans 5 ml de tampon cacodylate de

sodium à pH 7,2 (0,1M) contenant 2% de glutaraldéhyde (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis). Après 3 h de fixation à température ambiante, les cellules peuvent être conservées dans le fixateur à 4°C. Après centrifugation, les cellules sont lavées 3 fois dans le tampon cacodylate 0,1M pH 7,2. Les cellules sont ensuite inclues dans 1% d’agarose Low Melting Point (Sigma) dans l’eau, et immédiatement centrifugées avant solidification du mélange dans la glace. Le bloc d’agarose obtenu

est découpé en bloc de 1 mm3 maximum à l’aide d’une lame de rasoir et d’une loupe binoculaire. Les

découpes sont déposées dans des piluliers remplis d’eau jusqu’à l’étape de post-fixation.

Post fixation

L’eau est retirée des piluliers et les échantillons sont incubés pendant 1 h à température ambiante et à l’obscurité dans la solution de post-fixation : tétroxyde d’osmium 1% aqueux (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis) contenant 1,5% de cyanoferrate de potassium dans du tampon cacodylate 0,1M

pH 7,2. Deux lavages de 5 min dans le tampon cacodylate, suivis de trois lavages dans l’eau sont ensuite effectués.

Les échantillons sont post-fixés avec une solution d’acétate d’uranyle à saturation dans l’eau (~3%), à 4°C pendant 30 min et à l’obscurité. Après rinçage à l’eau, ils sont progressivement déshydratés avec des solutions d’éthanol de concentration croissante (50, 70, 95 puis 100%). Pour finir, deux incubations de 30 minutes dans l’oxyde de propylène sont réalisées.

Pendant ce temps, de la résine époxy fraiche est préparée (Embed 812:22, 5 g, DDSA 18 g, MNA 9 g, BDMA 1,2 g – Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis). Les blocs contenus dans chaque pilulier sont alors imprégnés dans quelques millilitres d’un mélange 50/50 propylène/résine, pendant 2 h à température ambiante puis une nuit, à température ambiante, dans de la résine pure. Le lendemain, le bain de résine pure est renouvelé et l’incubation prolongée de 5 h. L’inclusion finale est réalisée dans des moules de silicone (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis) et la polymérisation s’opère pendant 48 h à l’étuve à 60°C.

Coupes

Les coupes sont réalisées sur l’ultramicrotome Leica EM-UC7 après taille de la pyramide à la lame de rasoir. Les coupes ultrafines sont réalisées à l’aide d’un couteau diamant ultra 35° 2 mm (Diatome, Suisse), avec une vitesse de coupe de 1 mm/s et une épaisseur d’environ 65 nm. Elles sont récupérées à la surface de l’eau sur des grilles Cuivre 150 mesh (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis) préalablement nettoyées à l’acétone.

Les coupes peuvent alors être contrastées avec de l’acétate d’uranyle. Un mélange v/v d’acétate d’uranyle à saturation dans l’eau avec de l’éthanol 100% est mis en contact avec les grilles pendant 20 min. Plusieurs rinçages sont ensuite effectués : un premier rinçage rapide dans une goutte d’éthanol 50%, puis deux autres de 5 min dans une goutte d’eau distillée. Les grilles sont ensuite séchées sur papier filtre. Puis, les grilles sont incubées dans du citrate de plomb (réactif de Reynolds), pendant 7 min, et rincées à l’eau distillée (2x 5 min). Les coupes sont enfin séchées sur papier filtre et stockées dans des boîtes de Petri.

Détection des polysaccharides

Afin de contraster les polysaccharides, la réaction de PATAg est réalisée sur les coupes ultrafines collectées sur des grilles Or 150 mesh (Electron Microscopy Sciences, Etats-Unis). Les grilles sont

mises en contact avec une solution aqueuse d’acide périodique 1% pendant 20 min. Après plusieurs rinçages à l’eau distillée, les grilles sont placées dans une solution d’acide acétique 20% contenant 0,2% de thiocarbohydrazide pendant 30 min à l’obscurité. Elles sont ensuite rincées dans de l’acide acétique 10% puis dans l’eau. Enfin, elles sont révélées dans un bain de 30 min et à l’obscurité dans une solution aqueuse de protéinate d’argent, et rincées plusieurs fois dans l’eau.

Observation

L’observation se fait ensuite en mode haut contraste, à l’aide d’un microscope électronique en transmission (Hitachi H7650) en haute tension de 80 kV, équipé d’une caméra Gatan Orius 832.

2. Spectre de résistance

Un lysat phagique concentré est titré en parallèle sur la souche propagatrice et sur la souche dont la résistance doit être évaluée. La résistance d’une souche à un phage est déterminée par un rapport de concentrations, il est nommé EOP pour « efficiency of plating ». Il est calculé en divisant le titre en phages obtenu sur la souche à tester par le titre obtenu sur la souche de propagation du virus. Les résultats sont analysés comme suit :

- un rapport proche de 1 indique que la souche testée propage aussi bien le virus que sa

souche de propagation ;

- un rapport supérieur à 1 indique que la souche testée propage mieux le phage que sa souche

de propagation habituelle.

Dans ces deux premiers cas, la souche testée est dite sensible ou encore permissive.

- Un rapport nettement inférieur à 1 au contraire démontre une résistance de la souche testée

au phage.

3. Adsorption

L’adsorption est la première étape du cycle infectieux chez les bactériophages. Elle constitue la condition nécessaire pour aboutir à une lyse bactérienne. Les mesures d’adsorption sont faites en

diluée de façon à avoir une DO600nm de 0,2. 900 μl de culture sont gardés à 25°C. Le lysat phagique test, préalablement ramené à température ambiante, est ajouté de façon à créer une MOI de 0,01.

Ceci représente à ce stade une quantité de phages proche de 4 x 106 UFP. Le mélange est

immédiatement dilué, en transférant tout le volume dans 9 ml de MRS φ (25 °C) puis 500 μl de ce mélange dans 49,5 ml de MRS φ. Les cellules infectées ont ainsi été diluées au 1/1000. La dilution est répartie ensuite en tubes de 5 ml à raison de 2,5 ml par tube qui sont placés à 25°C. Un tube est prélevé à intervalle régulier, son contenu est filtré à travers une membrane PES de 0,22 μm, et le titre des phages non adsorbés est déterminé par la technique de la double couche à partir de ce filtrat. Les résultats sont exprimés en pourcentage de phages adsorbés en fonction du temps.