Partie IV. Quelle incidence des phages pendant l’élaboration du vin ?
II. Isolement des phages à partir d’échantillons œnologiques
1. Phages infectant O. oeni.
1.1. Préparation des échantillons de vins
Afin d’isoler des phages éventuellement présents dans les échantillons œnologiques, deux protocoles
Figure 23. Préparation des échantillons pour la recherche de phages
- Lors du protocole 1 l’échantillon brut est centrifugé à 5000 g pendant 5 minutes puis filtré
sur membrane PES (polyethersulfone) 0,22 μm. Les travaux de Mocé-Llivina et al. (2003), ont montré qu’aucune adsorption des oenophages sur la membrane n’est observée.
- Avec le protocole 2, l’échantillon est d’abord dilué au 1/10e dans du bouillon MRSΦ
additionné de pimaricine puis incubé pendant 5 jours à 25°C. L’échantillon dilué est ensuite centrifugé et filtré de la même façon que dans le protocole 1. Ce protocole permet de
multiplier les cellules d’O.oeni indigènes, et ainsi de (I) propager les phages potentiellement
présents si les souches sont sensibles et/ou (II) induire les prophages des souches lysogènes.
1.2. La double couche : titration d’échantillons environnementaux et de lysats phagiques
La concentration en phages des filtrats est déterminée par la technique de la double couche (Adams, 1959). Les milieux utilisés pour la technique de la double couche et pour les essais d’infection
respectivement) dans le but de favoriser la première étape du cycle infectieux des virus qui est l’adsorption sur la bactérie hôte. Le milieu obtenu prend le suffixe « φ » pour le différencier du milieu sans cations.
Une gamme de dilutions décimales du lysat filtré est réalisée en tampon phage (Tris 0,01M pH 7,5 ;
MgSO4 0,01M ; NaCl 4 g/l). Un aliquot de chaque dilution (100 μl) est mis en contact avec une souche
bactérienne sensible (200 μl à DO600= 0,2 – 0,3) dans un tube contenant une gélose MRSφ
semi-solide (5 ml ; 0,6 % p/v en agar) maintenue en surfusion à 55°C. Le mélange est immédiatement coulé à la surface d’une gélose MRSφ (2% d’agar) préalablement solidifiée dans une boîte de Petri. Les plages de lyse sont observables après incubation des boîtes à 25°C pendant 4 à 7 jours. Pour certains phages tempérés, les plages ont été observées plus précocement (dès 48 h), car elles étaient plus difficilement détectables après des incubations prolongées.
La dilution contenant entre 30 et 300 plages de lyse est retenue pour déterminer la concentration exacte de la suspension virale en utilisant la formule : N = (n x 10) x 1/c ; où n est le nombre de plages de lyse et c le coefficient de dilution. La concentration est exprimée en unité formant plage par millilitre (UFP/ml). Le seuil de quantification correspond à la concentration de 10 UFP/ml.
Une alternative moins onéreuse en milieu de culture a été parfois utilisée. Seule la souche sensible est ajoutée dans la gélose molle (MRSφ) qui est coulée sur la gélose dure. Après solidification, les différentes dilutions de lysat phagique sont déposées à la surface de la gélose sous la forme de gouttes de 10 μl. La dilution présentant un nombre de plages compris entre 5 et 25 est retenue. La concentration en phages est déterminée après comptage des plages de lyse obtenues en utilisant la formule : N= (n x 100) x 1/c ; où n est le nombre de plages de lyse et c le coefficient de dilution. La technique a pour avantage d’être plus économe en milieu, car elle permet de tester la totalité de la
gamme de dilutions d’un échantillon (10-1 à 10-8) sur une seule boîte. Son inconvénient est de
présenter un seuil de quantification réduit à 100 UFP/ml.
1.3. Repiquage des plages de lyse et purification des phages
Les différentes plages de lyse obtenues sont comparées visuellement selon, la taille (petite Ø ≤ 1 mm, moyenne 1 mm < Ø ≤ 3 mm, grande Ø > 3 mm) et l’aspect (clair ou trouble). Le prélèvement dans la gélose molle de chaque type de plage de lyse est réalisé à l’aide d’une pipette en verre. Le
phages contenus dans la gélose molle ont diffusé dans le milieu. Une gamme de dilutions de cet échantillon est ensuite réalisée puis analysée par la technique de la double couche avec la même souche de propagation IOEB S277 afin d’obtenir des plages de lyses isolées et homogènes. Une plage est à nouveau prélevée et la procédure de purification est répétée deux fois.
1.4. Production d’un lysat phagique concentré
En milieu solide
Après purification des phages à partir des plages de lyse, ces dernières sont reprises dans un volume de 500 µl. Cette suspension est diluée de façon décimale et un volume de 100 µl de chaque dilution est testé en double couche avec la souche utilisée pour l’isolement. La concentration de suspension virale donnant une lyse confuente est repérée et un ensemble de 10 boîtes sont préparées dans les mêmes conditions. Après incubation (environ 5 jours), les 10 géloses molles sont récupérées à l’aide
d’une spatule stérile, réunies et centrifiguées à 5000 g pendant 10 min. Le surnageant est ensuite
filtré sur membrane PES 0,22 μm. En milieu liquide
Cette technique est plus rapide et a été préférée dans cette étude. Elle a permis d’obtenir des lysats
concentrés de 106 à 1010 UFP/ml.
La propagation des phages purifiés est réalisée en milieu MRSΦ liquide. Dans le cas d’une première
propagation à partir d’une plage de lyse pure, 10 ml de culture en phase exponentielle à DO 0,1 de la souche de propagation sont additionnés de 50 μl (20 μl dans le cas des phages lytiques présentant des plages claires) de suspension virale. Lorsqu’un stock a déjà été préparé, la propagation est effectuée à la MOI optimale pour les oenophages, d’environ 1/300.
Un témoin sans phage est réalisé dans les mêmes conditions. Les échantillons sont incubés à 25°C pendant 72 h à 96 h et la croissance est suivie par inspection visuelle. Lorsque la lyse est observée, la culture est débarrassée des cellules bactériennes par centrifugation (10000 g, 5 min) et filtrée (0,22 μm).
2. Phages infectant les bactéries acétiques
La procédure d’isolement et de propagation des phages isolés est la même que celle décrite pour les phages d’O.oeni, avec quelques modifications.
Seuls quelques échantillons issus du protocole 1 décrit précédemment ont été utilisés pour rechercher les phages éventuellement présents dans les échantillons de vins sur des souches de
différentes espèces de bactéries acétiques du vin. Ainsi plusieurs souches indicatrices d’A. aceti, A.
pasteurianus, G. oxydans et G. cerinus ont été utilisées en double-couche. Lors de la réalisation de la technique de la double couche et de la propagation des phages, le milieu YPM a également été
supplémenté en CaCl2 16 mM (YPMΦ).
Les plages de lyses observées étant de taille réduite, l’ajout de glycine dans la gélose molle a été testé (100 mM, Le Marrec et al., 1997), mais n’influence pas la taille des plages.