La D,L-pipéritone a été dosée par la méthode en HS-SPME-GC-MS utilisée pour la quantification des terpènes et C13-norisoprénoïdes (Antalick et al., 2015a). Quelques modifications ont néanmoins été apportées.
L’étalon interne utilisé était le D-camphre (>97 %, Merck, Fontenay-sous-Bois, France). Vingt microlitres de la solution d’étalon interne (1 mg/L en solution alcoolique 100 %) ont été ajoutés à un flacon SPME contenant 3 g de NaCl, 5 mL de vin et 5 mL d’eau ultra pure (MilliQ, Millipore, Saint-Quentin en Yvelines, France). Les conditions d’extraction en HS-SPME étaient identiques à
154 la méthode décrite précédemment pour l’analyse des terpènes et C13-norisoprénoïdes (Partie III - Chapitre 1, paragraphe 2.4.4, page 97). Les conditions de séparation et de détection sont présentées dans le Tableau 34. La D,L-pipéritone a été détectée en mode SIM en sélectionnant les ions m/z 82 ; 5 et 110 et a été quantifiée avec l’ion m/z 2 (pic de base du spectre de masse de la pipéritone). L’étalon interne a été détecté avec les ions m/z 1 et 10 et quantifié avec l’ion m/z 108.
Des gammes étalon (de 80 ng/L à 10 µg/L) ont été réalisées à partir de la D,L-pipéritone racémique (pureté : 92 %, Chemos, Regenstauf, Allemagne). La répétabilité, le recouvrement, la limite de détection et de quantification ont été déterminés.
Tableau 34. Conditions d’extraction et d’analyse pour le dosage de la D,L-pipéritone
Appareil : HP 7890A (Agilent Technologies)
HS-SPME
Adsorption Fibre utilisée DVB/CAR/PDMS d’épaisseur de film 50/30 µM, longueur 1 cm
Adsorption à 40 °C pendant 30 min avec une vitesse d'agitation de 500 tr/min
Désorption et injection Température injecteur : 250 °C
Désorption pendant 1 min, injecteur en mode split-splitless (60 s)
GC-MS
Colonne chromatographique BP21, SGE, 30 m, 0,32 mm (d.i), 0,25 μm (e.f.)
Programme de température 40 °C pendant 5 minutes puis 3 °C/min jusqu’à 120°C (1 min) puis 12°C/min jusqu’à 220 °C, isotherme finale 15 min
Pression en tête de colonne 7 psi
Détection Spectrométrie de masse (5975c), impact électronique (70 eV), température : 2 0 °C, mode d’acquisition : SIM
2.3 Analyse sensorielle
2.3.1 Paramètres généraux de dégustation
Le panel 2 recruté pour l’étude des diverses reconstitutions aromatiques (Partie III - Chapitre 2, paragraphe 2.4.1.1, page 122) a réalisé l’ensemble des tests sensoriels associés à ce chapitre. Les conditions de dégustations étaient similaires à celles décrites précédemment (Partie III - Chapitre 2, paragraphe 2.4.1.2, page 122).
155 2.3.2 Reconstitutions aromatiques à partir d’extraits de vin
2.3.2.1 Extraction et fractionnement par chromatographie liquide
Cent millilitres de vin ont été extraits et fractionnés par chromatographie liquide selon le protocole opératoire précédemment décrit (Partie III - Chapitre 2, paragraphes 2.2 et 2.3, page 121).
Le vin MX04 (appellation Margaux, millésime 2004) utilisé ici pour les reconstitutions aromatiques est le même que celui décrit précédemment, tant pour l’étude initiale des reconstitutions aromatiques que pour l’identification de la D,L-pipéritone (Partie III – Chapitres 2 & 3).
2.3.2.2 Profils sensoriels
Des profils sensoriels ont été établis par le panel 2 pour les différentes reconstitutions aromatiques réalisées à partir des fractions obtenues par chromatographie en phase liquide du vin MX04 et du composé de référence de la D,L-pipéritone. L’intensité du descripteur « menthe » a été évaluée au moyen d’une échelle continue, bornée à gauche par le terme « peu intense » et à droite par le terme « très intense ». Afin de valider les résultats obtenus, chaque profil sensoriel a été dupliqué. La fiche de dégustation utilisée est présentée en Annexe 14.
Les diverses reconstitutions aromatiques ont été réalisées en solution hydroalcoolique (12 %, v/v) et sont présentées dans le Tableau 35.
Tableau 35. Profils sensoriels réalisés sur les différentes reconstitutions aromatiques du vin MX04
Echantillons comparés
RAtota RAtot – [F16+F17]b RAtot –[F16+F17] + pipéritone c a
RAtot : Reconstitution Aromatique totale (fractions 1 à 25)
b RAtot – [F16+F17] : Reconstitution Aromatique partielle (fractions 1 à 15 + fractions 18 à 25)
c
RAtot – [F16+F17] + pipéritone: ajout de la D,L-pipéritone dans la reconstitution aromatique partielle aux concentrations apportées par les fractions 16 et 17 du vin MX04
2.3.3 Influence du niveau de concentration de la D,L-pipéritone sur le caractère menthé des vins
L’impact de la D,L-pipéritone dans la note menthée des vins a été déterminé par un test de classement (NF ISO 8587 : 2006). Cinq échantillons de 25 mL à niveaux de concentration croissante en D,L-pipéritone ajoutée dans un vin rouge de Bordeaux (125 ng/L ; 250 ng/L ; 500 ng/L ; 1000 ng/L et 2000 ng/L) ont été présentés au panel. Ces niveaux de concentrations étaient
156 du même ordre de grandeur que ceux quantifiés dans les vins. Les panélistes devaient classer les échantillons dans l’ordre croissant selon le descripteur aromatique « menthe », du moins intense vers le plus intense. L’ordre de présentation des échantillons était spécifique à chaque panéliste. La fiche de dégustation utilisée est présentée en Annexe 15.
2.4 Analyses statistiques 2.4.1 Données chimiques
Les données chimiques relatives à la D,L-pipéritone ont été également analysées en utilisant un test non-paramétrique de Kruskall-Wallis (procédure de Steel-Dwass-Crichlow-Fligner, p-value <0,05), basé sur les trois groupes de vins identifiés selon leur appartenance à la typicité du bouquet de vieillissement (bons exemples, mauvais exemples et exemples intermédiaires).
Une analyse par régression PLS (Partial Least Squares) appliquée à l’ensemble des résultats de dosages a été réalisée, de manière similaire à celle décrite précédemment (Partie III - Chapitre 1, paragraphe 3.2, page 109).
L’ensemble du retraitement statistique a été effectué à l’aide du logiciel XLSTAT 2015 version 17.1 (Addinsoft, Paris, France).
2.4.2 Données sensorielles 2.4.2.1 Profils sensoriels
Les résultats des profils sensoriels des tests de reconstitutions aromatiques ont été analysés par ANOVA. Les conditions d’application de l’ANOVA ont été vérifiées sous le logiciel R : homogénéité des variances (test de Levene) et normalité de résidus (test de Shapiro-Wilk). Si les conditions de l’ANOVA n’étaient pas respectées, un test non-paramétrique de Mann-Whitney (comparaison par paires) ou de Kruskall-Wallis (comparaison multiples par paire suivant la procédure de Steel-Dwass-Crichlow-Fligner) était alors effectué (p-value <0,05).
2.4.2.2 Tests de classement par rangs
Les résultats obtenus pour le classement des échantillons de vins additionnés d’une concentration croissante en D,L-pipéritone ont été analysés par la méthode de Page (ordre prédéfini, NF ISO 8587 : 2006). Cette méthodologie vise à déterminer l’influence sur le niveau d’intensité du descripteur « menthe » de la concentration en D,L-pipéritone. On utilise pour cela le coefficient de Page, défini par L= R1+ 2R2 + 3R3 … pRp où R1 correspond à la somme des rangs pour
157 l’échantillon qui vient en premier dans le classement (dans notre cas, l’échantillon le moins concentré) et Rp l’échantillon qui vient en dernier dans le classement (dans notre cas, l’échantillon le plus concentré). Le calcul de L’ défini comme où p représente le nombre d’échantillons classés et j le nombre de dégustateurs permet d’obtenir le niveau de significativité. L’ suit approximativement une distribution normale standard. Ainsi, si L’est supérieur à 1,64, on considère qu’il existe des différences significatives au risque de 5 % entre les échantillons et que les panélistes tendent à ranger les échantillons dans l’ordre prédéterminé (dans notre cas, du moins au plus concentré).
3. RESULTATS-DISCUSSION
3.1 Mise au point de la méthode de quantification en HS-SPME-GC-MS de la