La méthode d’égalisation

Nous avons voulu d’une part enrichir les protéines faiblement exprimées pour les raisons expliquées dans le paragraphe précédent, et d’autre part identifier parmi ces protéines peu abondantes, celles possédant des résidus cystéines oxydés. L’enrichissement des protéines peu abondantes a été réalisé grâce au développement récent d’une méthode dite «d’égalisation» mise au point par la société CIPHERGEN (Guerrier et al., 2006), permettant d’obtenir une quantité identique de protéines faiblement et fortement exprimées. L’association de cette méthode d’égalisation avec notre méthode de purification des protéines oxydées après marquage des thiols par la Biotine-HPDP nous a permis d’identifier de nouvelles protéines oxydées.

a. Modification de la méthode d’extraction des

protéines en en milieu acide

La méthode d’égalisation est basée sur la différence d’affinité des protéines pour un substrat donné en milieu non dénaturant. L’égalisation des protéines en milieu natif est donc incompatible avec notre méthode de blocage de la réactivité

Nous avons du trouver une autre méthode de blocage de la réactivité des thiols durant la lyse cellulaire, compatible avec l’égalisation puis le marquage des thiols oxydés par la biotine-HPDP. Notre choix s’est porté sur l’ajout d’IAM au tampon non dénaturant d’extraction des protéines. Cependant, le repliement des protéines en milieu natif peut rendre inaccessible certains thiols à l’IAM, nous conduisant à réaliser après l’égalisation une seconde étape d’alkylation des thiols par l’IAM en milieu dénaturant, afin de s’assurer de la saturation des thiols libres. Le marquage différentiel des thiols par la Biotine-HPDP est ensuite réalisé comme décrit précédemment.

La méthode d’égalisation nécessite une quantité importante de protéines que nous avons fixée à 600 mg (soit 10 litres de culture à DO=2). Pour une telle quantité de protéines, nous avons utilisé une concentration maximale d’IAM correspondant à un rapport molaire IAM / résidu cystéine estimé à ~0,7. Ce rapport est loin de celui utilisé précédemment (200) (voir paragraphe A.1.d), mais à plus forte concentration l’IAM se solubilise mal. Nous avons considéré que cette quantité d’IAM devait suffire à bloquer les thiols réactifs généralement exposés en surface des protéines et accessibles au solvant (voir introduction I.A).

b. Principe de la méthode d’égalisation (figure 13)

Le principe de cette méthode est schématisé en figure 13A. Un extrait brut de protéines est incubé en présence d’une librairie d’hexapeptides synthétisée aléatoirement et fixée sur une phase solide. La synthèse combinatoire de la librairie d’hexapeptides est réalisée avec les 20 acides aminés et correspond en théorie à 206, soit 64 millions de possibilités de combiner différemment ces acides aminés. Environ 50 picomoles d’hexapeptides sont fixés sur des billes de 65 µm de diamètre. En fonction de la partie N-terminale des peptides, ces billes sont appelées «billes-E» (extrémité amine non modifiée) ou «billes-SE» (succinylation de l’extrémité amine en carboxyle). Les protéines vont se fixer à un peptide partenaire porté par les billes-E ou SE en fonction de leur affinité respective. Après avoir récolté le surnageant des billes, un lavage de la résine est ensuite effectué pour éliminer l’excès des protéines abondantes non fixées, puis les protéines fixées sur les billes égalisatrices sont éluées par un tampon dénaturant. Deux fractions de protéines sont ainsi obtenues après égalisation: le surnageant de la résine (non égalisé NE) et la fraction égalisée (E). Les protéines sont ensuite révélées par coloration au bleu de Coomassie après

une électrophorèse monodimensionnelle ou bidimensionnelle (figure 13B). La comparaison des deux fractions met clairement en évidence l’apparition de nouvelles protéines ainsi que la diminution des protéines abondantes, prouvant la très bonne efficacité de la technique d’égalisation en termes d’enrichissement des protéines faiblement exprimées.

Figure 13. Evaluation de l’efficacité de l’enrichissement des protéines peu abondantes par la méthode d’égalisation.

(A) Description schématique de la méthode d’égalisation. (B) Les cellules d’une souche sauvage cultivée dans 10L de milieu jusqu’à atteindre une DO600 de 2, sont

lysées dans un tampon non dénaturant en présence de 1M d’IAM, selon la technique décrite dans la partie «Méthodes». Les 600mg de protéines extraites sont ensuite incubées en présence des «billes-E». Le surnageant des billes est récolté, puis les billes sont lavées pour éliminer les protéines abondantes n’ayant pas trouvées de partenaires, et éluées pour purifier les protéines faiblement abondantes. Les protéines du surnageant des billes et les protéines éluées sont soumises à une électrophorèse soit monodimensionnelle, soit bidimensionnelle et révélées par coloration au bleu de Coomassie.

A.

+

+

élution

B.

Non Egalisé NE (surnageant billes) Égalisé E (éluat)

c. Purification des protéines oxydées de l’égalisat

(figure 14)

Après l’égalisation, nous avons procédé au marquage puis à la purification des protéines oxydées par la méthode utilisant la Biotine-HPDP. Afin de s’assurer que la modification des conditions expérimentales décrites ci-dessus ne perturbe pas la méthode, nous avons réalisé des contrôles similaires à ceux présentés dans la figure 11. Nous avons d’abord vérifié que la concentration d’IAM utilisée conduit à saturer les thiols libres, nous permettant ainsi de marquer spécifiquement les thiols oxydés, libérés par le DTT. Si l’on supprime la réduction par le DTT avant le marquage par la Biotine-HPDP, aucune protéine biotinylée n’est détectée (figure 14A, pistes 3-4 et 7-8), prouvant ainsi que le blocage des thiols libres par l’IAM est total. Nous avons ensuite vérifié la fixation des protéines biotinylées égalisées ou non sur la résine de streptavidine sépharose. Une très faible quantité de protéines biotinylées est détectée dans le surnageant de la résine, prouvant ainsi que les protéines biotinylées se fixent efficacement à la streptavidine-sépharose (figure 11A, pistes 2 et 6). Enfin, nous avons testé la spécificité de purification des protéines oxydées issues des deux fractions égalisées ou non. Pour cela, les protéines purifiées à partir d’extraits réduits ou non par le DTT avant le marquage par la Biotine-HPDP, sont déposées sur un gel SDS-PAGE et révélées par coloration au bleu de Coomassie (figure 11B). Nous observons la présence de quelques contaminants en l’absence de DTT (figure 11B, pistes 2 et 4), provenant probablement d’une interaction non spécifique de la résine avec des protéines non marquées par la Biotine-HPDP, comme nous l’avions observé précédemment (voir figure 11B).

Figure 14. Contrôle de la purification des protéines oxydées marquées par la Biotine-HPDP après égalisation.

Dix milligrammes de protéines égalisées (E) ou non (NE) dans la figure 13 sont successivement solubilisées en tampon UCTE contenant 200 mM d’IAM, 20 mM de DTT ou non et 0,5 mM de Biotine-HPDP. 5 mg de protéines biotinylées sont ensuite incubées en présence de 500 µL de streptavidine sépharose puis éluées en présence de DTT. (A) Les protéines égalisées ou non et marquées par la Biotine- HPDP sont déposées avant (Ch: charge) et après (St: surnageant) contact avec la résine sur un gel SDS-PAGE non réduit et révélées après un western blot avec la streptavidine-HRP. Le contrôle de la quantité de protéines déposées est réalisé par une coloration au rouge Ponceau. (B) Les protéines éluées sont déposées sur un gel SDS-PAGE et révélées par coloration au bleu de Coomassie.

DTT

+

-

+

-

non égalisé égalisé

DTT

+

-

+

-

A.

B.

Rouge Ponce 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 Ch. St Ch. St Ch. St Ch. St Streptavidine -HRP

5. Les méthodes de quantification de l’état redox des