1. La détection et l’identification des protéines sous
forme de disulfure par les électrophorèses diagonales
Cette méthode consiste à séparer les protéines sur un gel SDS-PAGE par deux migrations électrophorétiques successives, réalisées dans des conditions réductrices ou non. Pour cela, les protéines sont déposées sur un premier gel SDS- PAGE en l’absence de réducteurs afin de préserver les protéines oxydées. Après électrophorèse, une piste de ce gel est alors découpée puis déposée sur un second gel SDS-PAGE en présence d’agents réducteurs (voir schéma 18). Les protéines sont ensuite révélées par coloration. Cette méthode permet donc de distinguer trois catégories de protéines. La première concerne les protéines situées au dessus de la diagonale du gel. Ce profil de migration indique la présence de ponts disulfures intramoléculaires au sein des protéines. En effet, la formation d’un pont disulfure entre deux résidus cystéines structuralement éloignés provoque une compaction de la protéine qui migre alors plus rapidement en première dimension qu’en seconde. Inversement, la deuxième catégorie est constituée par les protéines situées au dessus de la diagonale du gel. Cette migration révèle la présence de ponts disulfures intermoléculaires entre les protéines. En effet, les protéines liées par un pont disulfure forment des complexes migrant plus lentement en première dimension qu’en seconde. Enfin, la troisième catégorie concerne les protéines formant la diagonale du gel. Leur migration indique l’absence de ponts disulfures. Les protéines d’intérêt peuvent ensuite être découpées dans le gel et identifiées par analyse en spectrométrie de masse. Cette méthode a par exemple permis d’identifier des protéines cytoplasmiques formant des ponts disulfures en présence ou non d’agents oxydants (Cumming et al., 2004), (Brennan et al., 2004).Toutefois, cette méthode ne permet pas de distinguer les protéines glutathionylées (-Cys-S-S-G) ou les protéines ayant un pont disulfure intramoléculaire entre deux résidus cystéines structuralement proches ne provoquant pas de compaction de la protéine. De plus, cette méthode essentiellement qualitative ne permet pas de quantification de l’état redox des thiols.
Schéma 18. Dessin explicatif du principe des gels diagonaux.
A et B représentent la première migration électrophorétique dans des conditions non réductrices. La seconde migration électrophorétique est ensuite réalisée dans des conditions réductrices. Schéma tiré de la revue (Stroher and Dietz, 2006).
2. La détection et l’identification des protéines
glutathionylées
Le GSH est un tripeptide synthétisé par deux réactions enzymatiques successives (voir paragraphe III.A.2.a). Par conséquent, l’incubation des cellules en présence d’un inhibiteur de la synthèse protéique et de cystéine S35 ne conduit qu’au marquage du GSH. Les cellules peuvent ensuite être exposées à différents agents oxydants induisant potentiellement une glutathionylation des protéines. Les protéines radiomarquées ou non sont ensuite extraites, soumises à une électrophorèse bidimensionnelle en conditions non réductrices et révélées par coloration et autoradiographie. La découpe des spots d’intérêt dans le gel permet ensuite l’identification des protéines par analyse en spectrométrie de masse. Cette méthode a notamment permis d’identifier de nombreuses protéines formant un pont disulfure intermoléculaire avec le GSH en présence ou non d’agents oxydants (Shenton and Grant, 2003), (Fratelli et al., 2002).
De façon similaire, l’incubation des cellules en présence de glutathion oxydé couplé à une molécule de biotine (Biot-GS-SG-Biot) permet de détecter les protéines capables de réaliser une réaction d’échange di-thiol/disulfure avec le Biot-GS-SG- Biot (Brennan et al., 2006). Les protéines ayant réagit avec cette molécule sont donc glutathionylées et biotinylées. Ces protéines peuvent ensuite être soit détectées après un western blot par chimiluminescence avec un anticorps streptavidine lié à
une peroxydase, soit purifiées par affinité avec la streptavidine sépharose permettant l’identification ultérieure des protéines glutathionylées.
Cette méthode ne permet d’analyser que les protéines capables d’être glutathionylées, et ne nous renseigne pas sur l’état redox de la totalité des thiols cellulaires.
3. La détection et l’identification de toutes les formes
oxydées
Nous avons choisi d’utiliser cette méthode globale pour notre analyse de l’état d’oxydation des protéines. Nous détaillerons donc cette technique plus précisément dans la partie «résultats», toutefois nous allons en résumer les principales étapes. Cette méthode est essentiellement basée sur le marquage sélectif des groupements thiols oxydés des protéines. Pour cela, la première étape consiste à bloquer les résidus cystéines libres par un agent alkylant des thiols indétectable afin d’empêcher une modification ultérieure de leur état redox. Les résidus cystéines oxydés sont ensuite réduits pour être ultérieurement marqués par un réactif des thiols détectables, tel qu’un agent alkylant couplé soit à une molécule fluorescente ou radioactive, soit à une molécule de biotine, afin de quantifier et/ou d’identifier respectivement les protéines oxydées. Les protéines marquées peuvent ensuite être soumises à une électrophorèse diagonale, mono- ou bidimensionnelle puis identifiées après coloration par spectrométrie de masse. En fonction de l’agent réducteur utilisé cette méthode nous permet soit de détecter tous les thiols oxydés, soit un sous ensemble spécifique des thiols oxydés.
a. Détection d’un ensemble spécifique de thiols oxydés
La réduction des thiols oxydés avec de l’acide ascorbique permet d’identifier les protéines nitrosylées (-S-NO) (Jaffrey et al., 2001). L’arsenite permet quant à lui de réduire les acides sulféniques (Saurin et al., 2004). Après la réduction spécifique des thiols oxydés, les protéines sont marquées par des molécules biotinylées comme la Biotine-maléimide (Saurin et al., 2004) ou la Biotine-HPDP (Jaffrey and Snyder, 2001) (Jaffrey et al., 2001), permettant leur purification et leur identification ultérieure.
b. Détection de l’ensemble des thiols oxydés
L’utilisation de réducteurs à large spectre comme le DTT et le "- mercaptoéthanol nous permet de détecter les cystéines engagées dans un pont disulfure, qu’il soit intra- ou intermoléculaire, ou liées avec une molécule de glutathion, ou existant sous la forme d’un acide sulfénique (voir paragraphe I.B). Les thiols oxydés ainsi libérés sont alors accessibles pour être marqués par différents réactifs. Par exemple, nous avons utilisé dans notre étude un agent alkylant radiomarqué le NEM C14 (Le Moan et al., 2006) tandis que Leichert et Jakob ont préféré l’IAM C14 (Leichert and Jakob, 2004). D’autres auteurs ont utilisé l’iodoacétamidofluorescéine (IAF) une molécule fluorescente couplée à l’IAM (Baty et al., 2005) (Minard et al., 2007). La Biotine-HPDP (Le Moan et al., 2006) ou la Biotine- cystéine (Eaton et al., 2002) sont également utilisés pour marquer les thiols oxydés afin de purifier et d’identifier ultérieurement les protéines oxydées.
c. Limites de ces méthodes globales
Ces méthodes ne différencient évidemment pas les ponts disulfures intra- et intermoléculaires. Elles sont généralement restreintes aux protéines abondantes, un problème que nous évoquerons dans la partie «résultats». De plus, nous verrons que les marqueurs des thiols ne sont pas toujours spécifiques des résidus cystéines (voir résultats). Néanmoins, ces méthodes d’analyse permettent de quantifier la variation de l’état d’oxydation des thiols dans différentes conditions expérimentales (Leichert and Jakob, 2004), (Le Moan et al., 2006).