Données de la littérature

a. Les SOD sont essentielles au métabolisme aérobie

Les organismes, tels que E.coli, S.cerevisiae, C.elegans et la drosophile, invalidés pour une ou plusieurs SOD, développent une intolérance vis-à-vis de l’O2,

indiquant la nécessité des SOD pour lutter contre l’extrême toxicité du superoxyde dérivé de l’O2. Chez S.cerevisiae, Sod1 et Sod2 semblent avoir des fonctions

distinctes, d’après les différents phénotypes associés à leur invalidation respective. Néanmoins, elles sont toutes les deux essentielles dans la protection contre la toxicité du superoxyde. L’absence de Sod1 et Sod2 n’est pas létale, mais provoque des défauts plus prononcés que la simple invalidation.

L’invalidation de SOD1 engendre différents défauts métaboliques, uniquement dans des conditions aérobiques. La perte de la Sod1 provoque l’incapacité des cellules à survivre en hyperoxie et l’apparition de différents phénotypes en normoxie: un défaut de croissance sur des substrats fermentescibles ou non (Gralla and Valentine, 1991), une haute fréquence de mutations spontanées (Huang et al., 2003) (Gralla and Valentine, 1991), une mort cellulaire précoce en phase stationnaire (sénescence accélérée) (Sturtz et al., 2001), une sensibilité aux composants générant de l’anion superoxyde (ménadione et paraquat) (Gralla and Valentine, 1991), et une auxotrophie en lysine (Liu et al., 1992) et méthionine (Chang and Kosman, 1990). L’auxotrophie en méthionine est d’ailleurs éliminée par la surexpression de Tkl1 (Slekar et al., 1996), une transkétolase de la voie des pentoses phosphate qui augmente la production de NADPH, indispensable aux thiorédoxine pour réduire la PAPS réductase, intervenant dans l’assimilation du soufre (voir introduction III).

Grâce à son activité d’élimination du superoxyde, Sod1 préserve l’intégrité des protéines à centre Fer/Soufre (Fe/S) (pour revue voir (Lill et al., 2006)). En son absence, l’augmentation de la production de superoxyde provoque la destruction des centres Fe/S (voir introduction et schéma 1), conduisant à une libération massive de fer libre dans la cellule (Srinivasan et al., 2000), (De Freitas et al., 2000). Le fer libéré est susceptible de générer un radical hydroxyle (OH!) hautement réactif (voir introduction I.B. réaction n°12 de Fenton), respons able de l’oxydation de l’ADN, des lipides et des protéines (pour revue voir (Imlay, 2003)). Cependant, le fer libéré n’est pas directement utilisable par la cellule pour réparer les centres Fe/S (Srinivasan et al., 2000), ce qui entraîne paradoxalement une carence en fer, détectée par le facteur de transcription Aft1, qui induit l’expression d’un transporteur membranaire de fer (Fet3) (De Freitas et al., 2000) pour augmenter de nouveau le fer intracellulaire afin de reconstruire les centres Fe/S. D’ailleurs, l’augmentation de fer intracellulaire par l’addition de fer (De Freitas et al., 2000) ou l’inactivation de protéines mitochondriales participant à l’assemblage des centres Fer/Soufre (Fe/S) (Ssq1, Jac1, Isu1, Nsf1) (Strain et al., 1998), restaure certains défauts métaboliques de $sod1, probablement par la reconstruction des centres Fer/Souffre (Jensen et al., 2004).

Le rôle de Sod1 dans le métabolisme des métaux est conforté par d’autres observations. Par exemple, l’addition de certains métaux ou l’augmentation de la concentration intracellulaire de cuivre ou de manganèse, par l’intermédiaire de l’inactivation ou de la surexpression d’enzymes impliquées dans leur transport ou leur séquestration (Lin and Culotta, 1996), (Lin and Culotta, 1995), (Liu and Culotta, 1994), (Lapinskas et al., 1995), élimine certains phénotypes de la souche $sod1. Le cuivre et le manganèse sont en effet des métaux de transition capables d’éliminer le superoxyde in vitro par une réaction chimique d’oxydoréduction. Une réaction semblable pourrait exister in vivo, mimant ainsi l’activité catalytique de Sod1. Néanmoins, l’addition de cuivre stimule l’expression d’une métallothionéine Cup1 capable d’éliminer le superoxyde selon un mécanisme similaire à Sod1 (Tamai et al., 1993). L’ensemble de ces données montrent donc une relation étroite entre le superoxyde, Sod1 et le métabolisme des métaux.

c. Le rôle de Ccs1 «Copper Chaperone for Sod1» dans

l’activation de Sod1

i. Sod1 nécessite du cuivre pour son activité catalytique

Le cuivre est un métal de transition essentiel à l’activité de certains enzymes, et pouvant être toxique à l’état libre (pour revue voir (Valentine and Gralla, 1997)). La concentration intracellulaire de cuivre libre est tellement bien régulée, qu’elle est de l’ordre de moins d’un atome par cellule (Rae et al., 1999) (pour revue voir (Lippard, 1999)). En effet, après son transfert dans le cytoplasme grâce à des transporteurs CTR (Copper TRansporter) de la membrane plasmique, le cuivre libre est rapidement lié à des métalloprotéines, comme la métallothionéine Cup1 et les métallo- chaperons. Les métallo-chaperons Atx1, Cox17 ou Ccs1, assurent le transport du cuivre dans des compartiments spécifiques puis son insertion sur ses protéines cibles: Atx1 sur Ccc2 dans la voie de sécrétion, Cox17 sur Sco1 et Cox11 dans la mitochondrie (pour revue voir(Valentine and Gralla, 1997)) et Ccs1 «Copper Chaperone for Sod1» sur Sod1 dans le cytoplasme. Ccs1 joue alors le rôle d’un récepteur soluble qui transfert à Sod1 son cofacteur cuivre, indispensable à son activité catalytique. Comme Sod1 dépend de Ccs1 pour son activité, l’invalidation de

CCS1 provoque les mêmes phénotypes que ceux d’une souche $sod1 (Culotta et al., 1997), (Gamonet and Lauquin, 1998).

En l’absence de Ccs1, Sod1 n’est plus capable d’acquérir son cofacteur, excepté en présence d’une très forte concentration de cuivre (Rae et al., 1999). Ccs1 est un métallochaperon très efficace, capable d’assurer sa fonction même dans des conditions de restriction de cuivre (Rae et al., 1999). Ccs1 catalyse l’insertion du cuivre dans Sod1 de façon post-traductionnelle, transformant la forme apoprotéique (sans cuivre) inactive de Sod1 en une forme active holoprotéique (avec cuivre) (Schmidt et al., 2000).

La Ccs1 possède 3 domaines distincts: le domaine I en N-terminal pour recruter et fixer le cuivre intracellulaire grâce à un motif MXCXXC similaire à celui d’Atx1, le domaine central II d’interaction avec Sod1 et le domaine III en C-terminal portant un motif CXC intervenant probablement dans la liaison du cuivre (Schmidt et al., 1999). D’après les données obtenus par cristallisation du complexe Sod1/Ccs1

disulfure intermoléculaire (voir schéma 22), indispensable au transfert du cuivre dans le site actif de Sod1 et par conséquent à l’activation de Sod1.

Schéma 22. Cristallisation du complexe Sod1/Ccs1.

La cystéine 57 de Sod1 forme une liaison disulfure intermoléculaire avec la cystéine 229 localisée dans le domaine III de Ccs1 (Lamb et al., 2001).

ii. Sod1 nécessite un pont disulfure intramoléculaire pour être active

Après le transfert du cuivre, le pont disulfure intermoléculaire Sod1/Ccs1 se résoud ensuite en un pont intramoléculaire au sein de Sod1. Ce pont est indispensable à la stabilisation structurale de Sod1, compatible avec son activité de dismutation. L’existence d’un pont disulfure intramoléculaire dans Sod1 n’a été montrée in vivo que récemment (Furukawa et al., 2004). La formation de ce pont disulfure est en fait dépendante de l’O2 et de Ccs1 (voir schéma 23) (Furukawa et al.,

2004) (Brown et al., 2004). Néanmoins, le mécanisme moléculaire et le lieu de formation de ce pont reste à éclaircir.

Contrairement à la levure, la Sod1 des mammifères ne possède pas les deux résidus proline à proximité d’une cystéine engagée dans la liaison disulfure, rendant ainsi possible la formation du pont disulfure intramoléculaire de Sod1 en l’absence de Ccs1 (Carroll et al., 2004) (Jensen and Culotta, 2005). Chez les mammifères, il existe donc une voie d’activation de Sod1 indépendante de Ccs1.

Schéma 23. Modèle de formation du pont disulfure intramoléculaire de Sod1.

La formation d’un pont disulfure intermoléculaire entre Sod1 et Ccs1 est catalysée par l’O2 et le cuivre (Furukawa et al., 2004), puis la cystéine libre de Sod1 résout ce

pont en pont disulfure intramoléculaire.

d. La localisation de Sod1 et Ccs1 dans l’espace

intermembranaire mitochondrial (EIM)

Sod1 et Ccs1 sont majoritairement localisées dans le cytoplasme, mais on retrouve 1 à 5% de Sod1 et de Ccs1 dans l’EIM, bien qu’aucune des deux protéines ne possède de pré-séquence N-terminale d’adressage à l’EIM (Sturtz et al., 2001). Par ailleurs, la présence de Sod1 dans l’EIM favorise l’augmentation de la résistance cellulaire en phase stationnaire et supprime l’auxotrophie en lysine et méthionine du mutant $sod1 (Sturtz et al., 2001). Sod1 est en fait importée dans l’EIM sous une forme immature, réduite et apoprotéique (Field et al., 2003). Ccs1 doit probablement être importé dans l’EIM sous une forme similaire. La Ccs1 y catalyse ensuite l’insertion du cuivre et la formation du pont disulfure intramoléculaire de Sod1 (voir schéma 24). Cependant, Sod1 est absente de l’EIM lorsque l’une de ses deux cystéines, ou l’une des cystéines du motif CXC de Ccs1, impliquées dans la liaison disulfure intermoléculaire avec Sod1, est mutée (Field et al., 2003). Ceci indique que la présence de Sod1 dans l’EIM est dépendante de son oxydation sous forme de disulfure, ce qui concorde avec la théorie du «folding trap» (pour revue voir (Herrmann and Kohl, 2007)), dont nous avons parlé dans l’introduction (voir paragraphe IV.C). Comme la formation du disulfure de Sod1 dépend de Ccs1, la

Schéma 24. Modèle de rétention de Sod1 dans l’EIM.

La Sod1 est importée sous une forme réduite et apoprotéique. Ccs1 catalyse ensuite l’oxydation et la métallation de Sod1 (Field et al., 2003). Cette réaction de maturation de Sod1 provoque sa rétention dans l’EIM.

e. L’invalidation de la Sod1 chez l’homme

Chez l’homme, des mutations du gène SOD1 sont associées à la sclérose latérale amyotrophique (FALS «familial amyotrophic lateral sclerosis»), une maladie neurodégénérative des motoneurones mortelle et incurable, la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer (pour revue voir (Noor et al., 2002)). Dans la plupart des cas, les mutations de SOD1 sont des mutations dominantes, provoquant un gain de fonction de Sod1 plutôt qu’une perte de son activité. La toxicité de ce gain de fonction pourrait éventuellement provenir de l’augmentation de la concentration intracellulaire d’H2O2, résultant de l’augmentation de l’activité de Sod1. D’autres

études ont proposé que l’agrégation des formes mutantes de Sod1 sur la membrane externe mitochondriale provoque l’obstruction de la machinerie mitochondriale d’import des protéines, ou encore que ces aggrégats séquestrent des protéines anti- apoptotiques.

3. Notre hypothèse de la formation du pont disulfure