Mécanisme de modulation de l’ARNm αENaC par la cycloheximide et les LPS

4.1.6.1. Modulation transcriptionnelle

Le niveau d’expression d’un transcrit dans la cellule résulte de l’équilibre entre la modulation de la transcription du gène et celui des mécanismes post-transcriptionnels qui vont moduler la stabilité de l’ARNm. Des travaux dans le laboratoire ont démontré que ces deux processus étaient impliqués dans l’inhibition de l’expression de l’ARNm αENaC par le TNF-α (Dagenais et al., 2006; Dagenais et al., 2004). Puisque les MAPK ERK1/2 (Bardou et al., 2012; Frank et al., 2003; Lin et al., 1999; Zentner et al., 1998) et p38 (Itani et al., 2003; Roux et al., 2005) sont connues pour moduler à la baisse la transcription du gène αENaC, nous avons voulu étudier dans un premier temps si les LPS et la cycloheximide pouvaient avoir un impact sur l’activité transcriptionnelle du promoteur αENaC murin. Seuls les LPS ont inhibé de façon significative l’activité luciférase après 6h de traitement [Figure 28]. De plus, les inhibiteurs des MAPK ERK1/2 et p38 ont diminué en partie l’inhibition de la transcription du gène par les LPS [Figure 29B]. De façon intéressante, le taux de diminution de l’activité du promoteur αENaC par les LPS est proportionnel à la chute du niveau d’ARNm αENaC observé dans les cellules traitées. Cette observation suggère que le mécanisme principal impliqué dans la modulation des ARNm αENaC par les LPS est une répression de la transcription du gène.

Dans un autre système, l’activation de la voie de signalisation Ras/ERK mène à l’inhibition de la transcription d’αENaC dans les cellules épithéliales salivaires (Lin et al., 1999). La MAPK ERK1/2 joue également un rôle dans l’inhibition de la transcription d’αENaC par le TGF-β dans les cellules épithéliales alvéolaires (Frank et al., 2003) et rénales (Chang et al., 2008). Le motif GRE présent sur le promoteur αENaC pourrait également être impliqué dans la modulation de la transcription dépendant de la MAPK ERK1/2 lors d’un traitement aux LPS. En effet, dans plusieurs modèles expérimentaux (TPA (Zentner et al., 1998), H2O2 (Wang et al., 2000) et TGF-β (Frank et al., 2003)), l’activation de la MAPK ERK1/2 entraîne une chute de la transcription du gène αENaC selon un mécanisme dépendant du motif GRE. Un des effets de l’activation de la MAPK ERK1/2 sur le promoteur αENaC semble donc d’inhiber l’activation transcriptionnelle induite par les glucocorticoïdes. Nos

résultats confirment l’importance de la MAPK ERK1/2 dans la modulation de l’activation du promoteur αENaC. Nos résultats montrent cependant que la MAPK p38 est également nécessaire pour diminuer l’expression de αENaC par les LPS.

L’inhibition des MAPK ERK1/2 et p38 ne peut complètement bloquer les effets des LPS sur la transcription. Nos résultats suggèrent donc que plusieurs facteurs de transcription travaillant en synergie pourraient moduler l’activité du promoteur αENaC. Dans les cellules H441, il a été démontré que NF-κB pouvait se lier à une séquence consensus dégénérée présente sur le promoteur αENaC. Un traitement aux LPS augmente l’activité de NF-κB dans ces cellules (Baines et al., 2010), ce qui suggère que NF-κB pourrait être un candidat potentiel dans la modulation transcriptionnelle par les LPS. Cependant il semble que les inhibiteurs de NF-κB ne puissent bloquer l’effet des LPS suggérant un mécanisme de modulation plus complexe qu’il n’y paraît [Observations non publiées]. L'activation de NF-κB pourrait cependant être complémentaire à celle des MAPK ERK1/2 et p38 afin d'obtenir un effet maximal sur le promoteur αENaC. Une étude du transcriptome des gènes modulés par le TNFα dans les cellules épithéliales alvéolaires a montré l'expression de plusieurs facteurs de transcription de la famille ETS. Ces facteurs peuvent être impliqués dans la répression de la transcription. Un niveau de transcrit modulé à la hausse pour plusieurs de ces facteurs de transcription en condition pro-inflammatoire et corrélé négativement avec l’expression des transcrits α, β, et γENaC a été observé [Annexe Figure 6]. De plus, des séquences consensus pour plusieurs facteurs de cette famille (TP53, ETS2, ETV3) sont présentes dans le promoteur αENaC, ce qui suggère que ces facteurs de transcription pourraient jouer un rôle dans l’inhibition de la transcription induite par les LPS.

Globablement, NF-κB pourrait inhiber conjointement l’expression génique de αENaC avec les facteurs de transcription ETS. Cette hypothèse devra être étudiée par une étude fonctionnelle du promoteur αENaC à l’aide de mutants de délétion. Des résultats préliminaires suggèrent que la région la plus proche du site d’initiation de la transcription serait essentielle pour l’effet des LPS [Annexe Figure 7]. En effet, même si l'inhibition de l'activité du promoteur par les LPS est réduite avec les mutants de délétion les plus courts (région proximale du début de la transcription), on note encore un effet des LPS ce qui suggère que ces régions seraient impliquées dans la modulation de la transcription du gène. Ces résultats cadrent bien avec ce que nous avons montré précédemment et qui suggère que plusieurs

facteurs de transcription (ou de répression), agissant sur différentes régions du promoteur, et activés par des voies différentes pourraient être impliqués dans la modulation à la baisse de la transcription de αENaC par les LPS.

La cycloheximide a eu un effet non significatif sur l’activité du promoteur après 6h de traitement et un impact significatif après 24h. Ces résultats suggèrent que la chute rapide de l’expression de l’ARNm αENaC observée à 6h [Figure 17] ne peut être expliquée par l’inhibition de l’activité du promoteur αENaC. De plus, l’inhibition des MAPK ERK1/2 et p38, suffisante pour réprimer l’effet de la cycloheximide, n’a pu restaurer l’activité du promoteur à 24h [Figure 29A]. Ce résultat pourrait être expliqué par une inhibition non spécifique de l’activité luciférase après 24h. Alternativement, la répression du promoteur αENaC pourrait être un mécanisme tardif et secondaire induit par la cycloheximide. De façon intéressante, ces résultats suggèrent que la régulation post-transcriptionnelle de la stabilité des ARNm αENaC pourrait être impliquée dans la modulation précoce de ces transcrits après 4h de traitement à la cycloheximide.

4.1.6.2. Modulation post-transcriptionnelle

Traditionnellement, la mesure de la stabilité d’un transcrit est obtenue en inhibant directement la machinerie transcriptionnelle de la cellule à l’aide d’un inhibiteur de la transcription comme l’actinomycine D. Un des problèmes de cette approche expérimentale est lié au fait que ces inhibiteurs sont également connus pour altérer le métabolisme cellulaire (Ljungman, 2007). De plus, l’actinomycine D inhibe complètement les effets de la cycloheximide sur l’expression de l’ARNm αENaC [Figure 30]. Ceci suggère que la transcription joue un rôle important dans la modulation de l’expression du transcrit αENaC par les LPS et la cycloheximide. Une discussion détaillée de l’impact de l’actinomycine D sur l’expression de l’ARNm αENaC sera présentée dans la section 4.2. Les résultats précédents révèlent que l’actinomycine D ne peut être utilisée pour mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC.

La séquence 3’ non traduite (3'UTR) d’un transcrit joue un rôle important dans la modulation de sa stabilité (Tourriere, Chebli, & Tazi, 2002). Pour cette raison, nous avons utilisé cette propriété pour déterminer, en absence d’actinomycine D, si le 3'UTR pouvait jouer un rôle dans la modulation de la stabilité des ARNm αENaC par la cycloheximide. Pour

étudier cette question, des clones luciférases ont été produits dans lesquels différents fragments du 3’UTR αENaC ont été insérés en 3’ de l’ARNm. L’activité luciférase de ces clones a été mesurée en présence de ces deux stress. La cycloheximide, contrairement aux LPS, a inhibé significativement l’activité luciférase de la construction composée du 3’UTR complet. [Figure 31A]. De plus, l’effet de la cycloheximide sur l’activité luciférase a été inhibé suite à la délétion d’une partie du 3’UTR [Figure 31B]. Ces résultats suggèrent que la partie distale du 3’UTR αENaC est impliquée dans la modulation de l’activité luciférase par la cycloheximide. Puisque les régions en 3’UTR des ARNm sont largement responsables de la modulation de la stabilité de ceux-ci, nos résultats suggèrent que les séquences 3'UTR αENaC pourraient jouer un tel rôle dans la modulation à la baisse des ARNm αENaC ainsi que dans la baisse d’activité des chimères luciférase par la cycloheximide.