Chapitre 3 : Résultats
3.3. Modulation de l’expression de l’ARNm αENaC par les protéines liant l’ARN
3.3.1. Identification de protéines liant la région 3’ non traduite de l’ARNm αENaC
Les protéines liant l’ARN sont des facteurs trans pouvant intervenir dans la modulation de l’expression d’un ARNm en altérant sa stabilité via une interaction avec la région 3’ non traduite. Pour cette raison, nous avons tenté d’identifier la nature des protéines présentes dans les cellules épithéliales alvéolaires pouvant se lier au 3’UTR αENaC à l’aide d’une technique de chromatographie d’affinité. Ainsi, la séquence complète du 3’UTR αENaC a été transcrite in vitro en incorporant de l’uridine triphosphate biotinylé. Cet ARN biotinylé a été couplé via la streptavidine sur des billes magnétiques pour générer la matrice d’affinité. Un extrait de protéines totales provenant de cellules épithéliales alvéolaires a servi de source de protéines liant l’ARN. Les protéines isolées ont été séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant et marquées par une coloration au nitrate d’argent. Afin de s’assurer de la spécificité des protéines interagissant avec le 3’UTR αENaC, un ARN non spécifique correspondant à la séquence inverse de l’ARNm β-actine a été utilisé en parallèle pour déterminer la nature des protéines qui ont un attachement spécifique au 3’UTR αENaC par rapport aux protéines qui auraient une affinité non-séquence spécifique à tous les ARN. La chromatographie d’affinité avec les séquences 3’UTR a permis d’enrichir de façon spécifique par rapport à l’ARN contrôle quatre bandes avec les poids moléculaires approximatifs suivants : 100, 68, 59 et 40 kDa [Figure 43].
Ces bandes ont été extraites en chambre blanche, digérées à la trypsine et analysées par spectrométrie de masse en tandem LC/MS/MS. Les résultats obtenus ont ensuite été analysés à l’aide du logiciel Scaffold 4. Le nombre de spectres uniques assignés a été présenté pour différentes protéines identifiées et la protéine sélectionnée a été encadrée en rouge [Figure 44]. Pour chaque bande, la protéine candidate a été sélectionnée selon plusieurs critères :
- Le poids moléculaire de la protéine candidate correspondait au poids moléculaire de la bande sélectionnée.
- L’abondance de la protéine dans chaque bande respective était élevée. - La protéine était absente dans les autres bandes extraites.
- Un enrichissement était observé entre l’isolation avec le 3’UTR αENaC et l’ARN non spécifique.
Voici la nature des protéines identifiées en appliquant tous ces critères : la DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 36 (DHX36), la « Poly(A)-binding protein » (PABP), la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène K (hnRNPK) et la « cytotoxic granule-associated RNA binding protein-like 1 » (Tial1) [Figure 44]. La PABP a été retirée de nos protéines d’intérêt puisque son rôle est majoritairement lié à l’interaction avec la queue polyadénylée de l’ARNm (Eliseeva, Lyabin, & Ovchinnikov, 2013). Afin de confirmer l'identité et l’interaction de ces protéines avec le 3’UTR αENaC, une chromatographie d’affinité a été effectuée et les protéines enrichies ont été séparées sur gel dénaturant suivi par un immunobuvardage de type Western dirigé vers les protéines d’intérêt. Ces immunobuvardages ont montré que les protéines DHX36, hnRNPK et Tial1 montraient un enrichissement significatif lorsque les séquences 3’UTR αENaC étaient utilisées lors de la chromatographie d’affinité par rapport à la séquence contrôle non spécifique [Figure 45].
Une technique de chromatographie d’affinité inverse a également été effectuée pour le candidat hnRNPK afin de déterminer si les ARNm αENaC pouvaient être spécifiquement enrichis par cette protéine. Une protéine chimérique GST-hnRNPK a été extraite à partir de bactéries E.coli DH5α et couplée à des billes magnétiques associées à du glutathion afin de servir de matrice d’affinité. Les ARN totaux de cellules épithéliales alvéolaires ont été extraits et incubés avec la matrice d’affinité. La mesure de l’expression des ARNm par RT-qPCR a permis d’observer un enrichissement moyen de l’ARNm αENaC de 36 fois avec la protéine GST-hnRNPK comparé à une isolation avec la protéine GST seule [Figure 46].
Figure 43. Isolation de protéines liant l’ARN par chromatographie d’affinité à l’aide du 3’UTR αENaC.
Des protéines liant l’ARN ont été purifiées par chromatographie d’affinité en utilisant des ARN biotinylés transcrits in vitro correspondants au 3’UTR αENaC ou un ARN non spécifique (brin négatif β-actine) couplés à des billes magnétiques, ainsi qu’un extrait protéique total de cellules épithéliales alvéolaires. Les échantillons de protéines isolées ont été séparés sur un gel de polyacrylamide 10% et ont été marqués par une coloration au nitrate d’argent. Les bandes spécifiques identifiées ci-haut ont ensuite été extraites en chambre blanche pour une analyse par spectrométrie de masse (LC/MS/MS) (n=3).
Figure 44. Identification des protéines liant le 3’UTR de l’ARNm αENaC par spectrométrie de masse.
Les bandes extraites à partir d’une chromatographie d’affinité ont été transmises à la plate- forme de protéomique de l’IRCM afin d’y effectuer une digestion à la trypsine suivie d’une analyse par spectrométrie de masse (LC/MS/MS). Les protéines identifiées à l’aide du logiciel Scaffold 4 sont représentées pour chaque extrait isolé, ainsi que leur nombre de spectres uniques associés. Le candidat protéique sélectionné pour chaque bande a été encadré en rouge.
Figure 45. Confirmation de l’identification des protéines liant l’ARN associées au 3’UTR αENaC.
Des protéines liant l’ARN ont été purifiées par chromatographie d’affinité en utilisant des ARN biotinylés transcrits in vitro correspondants au 3’UTR αENaC ou un ARN non spécifique (brin négatif β-actine) couplés à des billes magnétiques, ainsi qu’un extrait protéique total de cellules épithéliales alvéolaires. Les échantillons de protéines isolées ont été séparés sur un gel de polyacrylamide 10%, suivi par un immunobuvardage de type Western dirigé contre DHX36, hnRNPK ou Tial1. Un immunobuvardage de type Western représentatif est présenté pour chaque protéine (n≥4).
Figure 46. Enrichissement de l’ARNm αENaC par la protéine hnRNPK par chromatographie d’affinité GST.
Une protéine chimérique GST-hnRNPK produite par des bactéries a été couplée à des billes magnétiques recouvertes de glutathion pour générer une matrice permettant d’enrichir les ARN capables de s’attacher à hnRNPK. Les ARN fixés sur la protéine hnRNPK ont été extraits et le niveau d’expression de l’ARNm αENaC a été évalué par RT-qPCR. Les données sont exprimées en niveau d’enrichissement de l’ARN αENaC avec GST-hnRNPK comparé à l’enrichissement avec la protéine GST seule (n=2).
3.3.2. Modulation de l’expression de l’ARNm αENaC par les protéines liant
l’ARN
Afin d’identifier l’impact des protéines identifiées précédemment sur la modulation de l’ARNm αENaC, des cellules épithéliales alvéolaires ont été transfectées avec le plasmide pcDNA3 exprimant les protéines DHX36, hnRNPK ou Tial1. Le niveau d’expression de ces protéines dans les cellules transfectées a été comparé à celui de cellules transfectées avec le plasmide pcDNA3 vide. La surexpression des protéines DHX36, hnRNPK et Tial1 dans les cellules transfectées a été confirmée par immunobuvardage de type Western [Figure 47].
Figure 47. Surexpression des protéines DHX36, hnRNPK et Tial1 dans les cellules épithéliales alvéolaires
Des cellules épithéliales alvéolaires ont été transfectées avec un plasmide pcDNA3 codant pour les protéines DHX36, hnRNPK ou Tial1, ainsi qu’avec le vecteur vide. Le niveau d’expression de chaque protéine a été évalué 72h post-transfection par immunobuvardage de type Western. Un immunobuvardage de type Western représentatif est présenté pour chaque protéine (n=3).
N.B. La forte surexpression de hnRNP K (RBP +) camoufle son expression endogène (pcDNA3) * voir Annexe Figure 1.
Les effets de la surexpression de ces protéines sur la concentration des ARNm αENaC endogènes ont été testés par RT-qPCR. La surexpression des protéines DHX36, hnRNPK et Tial1 a inhibé significativement l’expression de l’ARNm αENaC après 72h post-transfection à des niveaux de 59 ± 9%, 53 ± 11% et 49 ± 6% comparée aux cellules transfectées avec le vecteur vide [Figure 48].
Figure 48. Modulation de l’expression de l’ARNm αENaC par des protéines liant l’ARN
Des cellules épithéliales alvéolaires ont été transfectées avec le plasmide pcDNA3 vide ou codant pour les protéines DHX36, hnRNPK ou Tial1. L’expression de l’ARNm αENaC a été quantifiée par RT-qPCR 72h post-transfection et a été exprimée en % d’expression de l’ARNm αENaC comparé aux cellules transfectées avec le vecteur vide (contrôle) ± ESM après la normalisation avec la β-actine. (One-sample t test, * : P<0,05 vs contrôle; n=4)