Hypothèse et Objectifs

La modulation du canal αENaC a été caractérisée à plusieurs niveaux. Les connaissances sont nombreuses en ce qui concerne la modulation de l’activité du canal à la membrane cellulaire, son expression protéique, ainsi que son activation par clivage protéolytique et tous les mécanismes régulant finement la dégradation et le recyclage du canal. Par contre, peu de travaux se sont intéressés aux mécanismes qui modulent le niveau des ARNm αENaC lors d’un stress pathophysiologique dans les cellules épithéliales alvéolaires.

Il existe de nombreux stress pathophysiologiques qui peuvent interférer avec le bon fonctionnement de l’appareil respiratoire. Parmi ceux-ci, les stress inflammatoires (Dagenais et al., 2004; Roux et al., 2005), oxydatifs (Xu & Chu, 2007) et infectieux (Dagenais, Gosselin, Guilbault, Radzioch, & Berthiaume, 2005a; Hussain et al., 2013) ont tous la particularité d’avoir pour conséquence une inhibition de l’expression de l’ARNm αENaC. Cette modulation à la baisse du transcrit αENaC est une étape importante qui s’inscrit dans un programme concerté pour diminuer l’expression et la fonction du canal dans les cellules alvéolaires soumises à un stress pathophysiologique. Il existe par exemple une corrélation directe entre le niveau des ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires traitées au TNF-α et le courant ENaC détecté dans ces cellules (Dagenais et al., 2004). De même, la diminution de clairance liquidienne dans les poumons transplantés est associée à une diminution des ARNm α et βENaC, ainsi qu’à une diminution de la protéine αENaC essentielle au fonctionnement du canal (Sugita et al., 2003b). Qu’il y ait un lien direct ou indirect entre la diminution du transcrit et celle de la protéine ou de l'activité du canal, il est clair qu’une modulation très stricte de la quantité des ARNm αENaC est mise en place en condition pro-inflammatoire.

L’expression d’un ARNm dans la cellule peut être affectée par l’activité transcriptionnelle de son promoteur, mais également par la modulation de la stabilité du messager. Dans le cas du transcrit αENaC, le rôle de son promoteur en condition de stress pathophysiologique a été mis en lumière à plusieurs reprises, tel que décrit dans le chapitre 1.5.2. À l’opposé, l’implication de la stabilité dans la modulation de l’expression de l’ARNm αENaC a été peu investiguée à quelques exceptions, et il n’existe aucune étude sur les mécanismes impliqués dans cette modulation. De même, si un rôle des séquences 5’UTR de

αENaC a été démontré dans la modulation de la traduction (Banasikowska, Post, Cutz, O'Brodovich, & Otulakowski, 2004b; Otulakowski et al., 2001; Otulakowski, Rafii, & O'Brodovich, 2004), le rôle du 3’UTR du messager dans le contrôle de l’expression génique de ENaC n’a pas été étudié jusqu’à présent.

1.7.1. Hypothèse de recherche

Notre hypothèse de recherche postule que l’inflammation ou le stress cellulaire pourraient inhiber l’expression de l’ARNm αENaC via une modulation de sa stabilité. Cette modulation impliquerait l’attachement de facteurs protéiques trans au 3’UTR de l’ARNm αENaC. Afin de vérifier cette hypothèse, différentes stratégies ont été développées et sont décrites dans les objectifs suivants.

1.7.2 Objectif général

Caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pourrait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit.

1.7.3. Objectifs spécifiques

- Définir par quels mécanismes et par quelles voies de signalisation des stress pathophysiologiques de natures différentes vont affecter l’expression des ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires.

Pour cet objectif, la cytokine TNF-α, quoique pertinente dans un contexte pathophysiologique, n’a pas été utilisée dans l’induction d’un stress inflammatoire. En effet, cette cytokine provoque une modulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle complexe au niveau de l’ARNm αENaC (Dagenais et al., 2006; Dagenais et al., 2004). C’est pourquoi, dans le cadre de cet objectif, nous avons tenté de développer deux modèles de stress dont la modulation de l’ARNm αENaC puisse impliquer de façon spécifique soit l’activité transcriptionnelle du promoteur αENaC, soit la modulation de la stabilité du transcrit. Pour cette raison, nous avons comparé comment les LPS de la bactérie Pseudomonas aeruginosa

(Baines et al., 2010) utilisés ici pour induire un stress inflammatoire et comment la cycloheximide connue également pour induire un stress cellulaire (Dagenais et al., 2001b) affectent le niveau des ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires. La cycloheximide n’est pas connue comme étant un modèle physiologique pour les cellules épithéliales alvéolaires. Cependant, d’un point de vue expérimental, c’est un modèle intéressant puisque cette drogue inhibe de façon importante et rapide l’expression de l’ARNm αENaC (Dagenais et al., 2001b; Migneault et al., 2013). Bien que nous ne connaissions pas la nature exacte du stress cellulaire induit par la cycloheximide aux concentrations utilisées dans notre étude, il est possible que celle-ci entraine une certaine réponse inflammatoire, différente de celle induite par les LPS, dans les cellules épithéliales alvéolaires.

1.7.3.2. Objectif no.2

- Définir le rôle du 3’UTR dans la modulation de la stabilité de l’ARNm αENaC.

En moyenne, la taille du 3’UTR est approximativement de 500 nucléotides chez le rat (Chen et al., 2012). Dans le cas du 3’UTR de l’ARNm αENaC du rat, celui-ci représente près de 900 nucléotides, soit environ le tiers du transcrit. Cette taille est nettement supérieure à la moyenne retrouvée chez le rat, suggérant un rôle du 3’UTR αENaC dans la modulation post- transcriptionnelle du messager. Pour cet objectif, un système d’expression Tet-Off a été développé afin de déterminer le rôle des séquences du 3’UTR αENaC dans la modulation de la stabilité du transcrit dans les cellules épithéliales alvéolaires en conditions physiologique et pro-inflammatoire.

1.7.3.3. Objectif no.3

- Caractériser la modulation de la stabilité de l’ARNm par les protéines liant l’ARN (RBP). La région 3’UTR des ARNm possède des séquences cis pouvant servir de site d’attachement à divers facteurs modulant la stabilité de l’ARNm αENaC tels que les protéines liant l’ARN. Pour cet objectif, les protéines capables de s’attacher aux séquences 3’UTR αENaC ont été purifiées par chromatographie d’affinité et identifiées par spectrométrie de masse. Par la suite, l’impact de plusieurs de ces protéines sur l’expression des ARNm αENaC a été étudié dans les cellules épithéliales alvéolaires surexprimant ces RBP.

Chapitre 2 : Matériels et Méthodes